05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳

实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶EcoRIRestrictionEnzyme识别序列：------G↓AATTC------------CTTAA↓G------BamHIRestrictionEnzyme识别序列：------G↓GATCC------------CCTAG↓G------HindIIIRestrictionEnzyme识别序列：------A↓AGCTT------------TTCGA↓A------每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：pH范围：7.5~8.0缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）、NaCl、MgCl2、巯基试剂（巯基乙醇、二硫苏糖醇）温育温度：37℃反应体系：DNA(1ug或更少)5ul10xBuffer2ulRestrictionEnzyme3ulH2O10ulTotal20ul混匀，37度保温30分钟琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。电泳在一个电场的作用下，在某种支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。电泳法的优点凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。样品用量少。设备简单。可在室温进行。操作简便，费时不多不同类型的电泳，有不同的用途。改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。琼脂糖琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2试剂TBE电泳缓冲液45mmol/LTris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0加样缓冲液0.25%溴酚蓝，40%蔗糖EB（溴化乙锭）染色液（有毒）1ug/ml，用1×TBE配制Blue/Orange6xLoadingDye组成10%Ficoll4000.25%bromophenolblue（深蓝色）0.25%xylenecyanloFF（天蓝色）0.4%orangeG（黄色）10mol/LTirs-HCl(pH7.5),50mol/LEDTA使用量5份DNA溶液加1份Blue/Orange6xLoadingDye溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)EB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。在电泳后，将凝胶浸入浓度为0.5ug/ml的EB溶液中染色10～15min。琼脂糖凝胶经EB染色后，在紫外光照射下，可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。操作步骤酶切反应反应体系：λ－DNA5ul10xBuffer2ulHindIII3ulH2O10ulTotal20ul混匀，37度保温30分钟电泳前的准备工作准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，用蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况决定是否更换buffer。排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果4.计算agarose的用量和制胶buffer的用量记录。实验记录备查制胶步骤注意事项1.称量agarose和加入bufferBuffer不要用成蒸馏水，称量相对准确2.融胶。加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀。小心烫手，注意不要加热过度使胶冲出瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.封边和倒胶。使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，先用少量的凝胶封边，再沿着制胶板的一侧，缓缓地将凝胶一次性倒入。制胶的桌面相对水平。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶至少1mm。上样和电泳步骤注意事项1.样品中加入loadingbuffer使其终浓度为1X，混匀Loadingbuffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。2.点样匀速加入。避免碰坏胶孔。枪头不要吸气泡，拔起时不要猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。加样的速度在保证质量的前提下越快越好。点样的量不要太大，点样量过大不仅容易溢出污染邻位样品，而且容易导致DNA条带脱尾和模糊不清。3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。经常检查，防止样品跑出胶等意外发生。染色和成像步骤注意事项1.染色用0.5ug/ml的EB溶液浸染10－15分钟。2.调整镜头的拍摄范围和焦距，成像3.保存或打印照片做分析记录点样在DNA样品中加入LoadingDye混匀。Sample1：取自提DNA5ul+2ulLoadingDyeSample2:λ-DNA/HindIII20ul+4ulLoadingDye用加样器吸取样品点入点样孔：Sample1：7ulSample2:15ul987654321987654321点样前先安排好各点样孔的样品，做好纪录，然后依次从右下角开始按顺序点样。提示电泳接通电源，200v恒压电泳1小时。染色和观察切断电源，取出胶模，将凝胶置入EB染色液中染色10-15分钟。取出凝胶，置于紫外灯下观察DNA电泳带型。警告胶染色和观察时一定要带手套！！！EB（溴化乙锭）诱变！！！1234←RNA提示将凝胶旋转180o，置于紫外灯下观察DNA电泳带型。1自提DNA2λ-DNA/HindIII3λ-DNA结果记录与分析绘制电泳图谱λ-DNA/HindIIIMarkersλ-DNA/HindIIIMarkers是利用EcoRI彻底降解λ-DNA后再进行内切酶的灭活处理和乙醇沉淀制备的。贮藏缓冲液：10mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mol/LNaCl,1mol/LEDTAλ-DNA/HindIIIMarkers片段大小（bp）和电泳带型示意图点样孔2313094166557436123222027