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当前位置:首页 > 行业资料 > 酒店餐饮 > 实验33生物芯片的点样制备及检测核酸多态性
实验27动物细胞基因组DNASNP的生物芯片检测实验目的:制作点样型DNA芯片,用于检测特定的DNA片段;合成检测10条特定基因(或位点)的DNA探针,点样制备DNA微阵列芯片,检测上面实验中制备的双色荧光标记cDNA。实验原理:1、SNP的概念及意义单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中昀常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在群体中的发生频率不小于1%。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有1个,目前已发现约400万个SNP遗传标记。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异,这种变异可由单个碱基的转换(transition)[指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤(G-A)、嘧啶与嘧啶(T-C)间的替换]或颠换(transversion)[指发生在嘌呤与嘧啶(A-T、A-C、C-G、G-T)之间的替换]所引起,也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。理论上讲,SNP既可能是二等位多态性,也可能是3个或4个等位多态性,但实际上,后两者非常少见,几乎可以忽略。因此,通常所说的SNP都是二等位多态性的。SNP变异可能是转换(C→T,在其互补链上则为G→A),也可能是颠换(C→A,G→T,C→G,A→T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异,具有转换型变异的SNP约占2/3,其它几种变异的发生几率相似。转换已C→T为主(图27-1),其原因是CpG的C是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T,CpG也因此变为突变热点。图27-1(From:)根据人类基因组的研究资料,DNA的核苷酸序列在不同个体中至少有99.9%是相同的;但在任意选定的两个个体中,DNA序列可以有数以百万计的变异点,其中绝大多数都属于SNP。SNP是人类基因组DNA序列中昀常见的变异形式。据估计,发生在基因的蛋白质编码区的约4万个SNP,可以导致蛋白质合成时氨基酸的“错义”改变。现已知,至少93%的人类基因都存在SNP。人类基因组SNP研究所揭示的人种、人群和个体之间DNA序列的差异以及这些差异所表现的意义将对疾病的诊断、治疗和预防带来革命性的变化。SNP被称为“第三代DNA遗传标记”。这种遗传标记的特点是单个碱基的置换,与第一代的RFLP及第二代的STR以长度的差异作为遗传标记的特点截然不同。SNP的分布密集,在人类基因组中被认为有300万个以上的SNP遗传标记,这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限,因此被认为是应用前景昀好的遗传标记物。2、SNP检测方法传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术,如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析(DGGE),温度梯度凝胶电泳(TGGE)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、等位基因特异聚合酶链反应分析(AS-PCR)等。但这些必须通过凝胶电泳进行检测,因此,距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。传统的RFLP只能检测到SNP的一部分,测序技术既费时费力,又不易实现自动化,不适宜于SNP的检测;SSCP则很难满足自动化的需要,难以大规模开展工作。因此,这些方法均未被广泛采用。目前已有多种新兴的方法可用于SNP检测,如变性的高效液相色谱检测(DHPLC)、等位基因特异性延伸(allele-specificprimerextension,ASPE)、单碱基延伸(singlebaseextension,SBE)技术、DNA列阵微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接(OLA)、TaqMan探针技术、分子信标(molecularbeacons)技术、Minisequencing、DNA芯片等。其中基因芯片技术具有高通量、简便快捷、平行化和成本低廉等优点,且芯片技术的高密度探针矩阵可为大规模SNP分型提供一个高效检测途径。芯片技术平台包括微球微点阵,纤维薄膜微点、玻璃片基微点阵芯片等,其探针密度跨越范围几百至上百万不等,其中GoldenGateTM所使用的微球芯片密度可达100万,AffymetrixSNP芯片密度近200万。DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片(DNAchip),也称生物芯片(biochip),其大小与计算机上的CPU芯片相似,约1cm2或更大些,以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片,芯片上铺了一层肉眼看不见的DNA纤维“地毯”,即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后,被切成长短不一的片段,经荧光化学物质标记后,注射到嵌有芯片的载片上。由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关,因此通过激光扫描,即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。目前,基于DNA芯片的SNP检测平台以及功能成为高通量、大规模、全基因组SNP检测分析的主流技术。其中典型的代表是Affymetrix公司的SNP检测高密度DNA微阵列芯片。此外,还有Illumina公司的SNP检测芯片,如Beadlab平台,是Illumina公司整合GoldenGate多通道位点特异性延伸扩增检测方案和BeadArray高密度微阵列技术,开发而成的顶级高通量SNP基因分型系统,每天可完成超过44万个基因分型。新的AffymetrixGenome-WideSNPArray6.0(图27-2)产品的特点是超过1,800,000个遗传变异标志物,包括超过906,600个SNP和超过946,000个用于检测拷贝数变化的探针。大约有482,000个SNPs来自于前代产品500K和SNP5.0芯片。剩下424,000s个SNP包括了来源于国际HapMap计划中的标签SNPs,X,Y染色体和线粒体上更具代表性的SNPs,以及来自于重组热点区域和500K芯片设计完成后新加入dbSNP数据库的SNPs。SNP6.0还包括了202,000个用于检测5,677个已知拷贝数变异区域的探针,这些区域来源的于多伦多基因组变异体数据库。该数据库中的每个3,182个非重叠片断区域分别平均用61个探针来检测。除了检测这些已知的拷贝数多态区域,还有超过744,000个探针平均分配到整个基因组上,用来发现求知的拷贝数变异区域。设计方面SNP6.0芯片只取昀佳SNP位点和每组等到位基因的一个完全匹配,并有三次重复检测,所以总共只有六个探针(表22-1)。表22-1Affymetrix公司的SNP5.0和SNP6.0芯片的参数SNP5.0SNP6.0芯片张数11覆盖SNP位点数(SNPs)500,568906,600拷贝数变化检测探针数(CNVs)420,000946,000全基因组上覆盖的平均物理距离5.8Kb3.1Kb每个SNP位点探针数86位点检出率≥99%≥99%一致性≥99%≥99%图27-2Affymetrix公司的SNP6.0芯片图27-3反映了运用Affymetrix公司的SNP6.0芯片完成全基因组SNP检测的技术流程。图27-3OverviewoftheGenome-WideHumanSNPAssayKit5.0/6.0.Briefly,totalgenomicDNA(500ng)isdigestedwithNspIandStyIrestrictionenzymesandligatedtoadaptorsthatrecognizethecohesive4bpoverhangs.Allfragmentsresultingfromrestrictionenzymedigestion,regardlessofsize,aresubstratesforadaptorligation.Agenericprimerthatrecognizestheadaptorsequenceisusedtoamplifyadaptor-ligatedDNAfragments.PCRconditionshavebeenoptimizedtopreferentiallyamplifyfragmentsinthe200to1,100bpsizerange.PCRamplificationproductsforeachrestrictionenzymedigestarecombinedandpurifiedusingpolystyrenebeads.TheamplifiedDNAisthenfragmented,labeledandhybridizedtothearray.(From:)3、微点样法制备SNP检测DNA微阵列芯片微点样法是制备DNA微阵列芯片的主要方法之一。该方法将事先设计并合成好的DNA探针通过点样仪(arrayer)按照一定的排列方式微量针点或喷点固定到固体基底表面,制备成DNA微阵列芯片(图27-4)。在芯片的制备过程中,基底材料的选择及其表面的化学修饰是至关重要的。许多材料都可以用作生物芯片的基底材料,如滤膜、玻璃片以及水凝胶膜。图27-4一种点样仪(arrayer),嵌入图为点样针3.1、载玻片及其氨基硅烷化修饰由于玻片容易获得,具有本地荧光低、透明度高、热学性质好、硬度高、易于在表面进行化学修饰以固定核酸探针等特点,从而使之成为一种目前昀为常用的生物芯片基底材料之一。此外载玻片表面光滑,而且没有多孔结构,标记的靶序列可以直接与固定探针结合,而不会受扩散效应的影响,具有较高的局部浓度和较快的杂交反应速度。这种没有多孔结构的表面也非常适合洗脱多于探针和非特异性吸附的标记靶标序列。大多数商品化的用于制备生物芯片的载玻片已经经过多聚赖氨酸、氨基硅烷或氨基修饰(图27-5)。尽管光滑无孔的载玻片在生物芯片应用中具有很多优点,但是这种载玻片在固定结构化生物分子,如抗体分子或结构化的寡核苷酸探针分子时很难保持其固有的分子结构;而且这种载玻片表面的固定能力有限,影响了检测灵敏度。载玻片的氨基硅烷化及DNA固定原理如图27-5所示。氨基修饰氨基硅烷化基底需要使可逆的希夫碱(Schiff'sbase)还原成稳定的烷胺键化合物,图27-6为硼氢化钠还原步骤示意图。3.2、载玻片上涂覆的水凝胶或聚合物膜:为了解决平滑无孔载玻片的缺陷,将一种功能化的三维亲水多孔凝胶(如聚丙烯酰氨凝胶块)铺在载玻片表面,作为固定DNA分子的基底材料(图27-7)。多孔水凝胶材料结合了平滑载玻片反应速度快和孔状材料可提供类似于液相的环境及较大的固定能力等优点。在这种基底上进行的杂交反应更接近于均一液相环境中的反应而不是固液界面的反应。而且这类多孔凝胶膜可在通用商品化的精密度较高的芯片点样仪和扫描仪上使用。这类水凝胶膜的缺陷是具有较高的荧光背景,反应完后需要经过长时间的清洗,才能除去表面非特异吸附的标记靶标;其次,在于液体接触时遇到较高杂交温度很容易破碎甚至溶解;昀后,它的制备过程比较复杂,商品化的基片价格昂贵。琼脂糖中邻近的羟基可在较为温和的条件下被高碘酸钠氧化,生成醛基。醛基可以与修饰了氨基的DNA分子探针反应形成希夫碱(图27-7)。图27-5氨基硅烷化玻片的表面处理及氨基修饰的DNA探针的固定。醛基可以与修饰了氨基的DNA分子探针反应形成希夫碱(Schiff'sbase)。图27-6硼氢化钠还原希夫碱形成烷胺键化合物步骤示意图3.3、寡核苷酸DNA微阵列芯片检测SNP技术:寡核苷酸芯片检测基因突变技术是基因芯片技术的一种。该技术用于检测基因突变的基本原理是在玻璃、硅等载体上,根据检测需要,设计、固定多个特异的寡核苷酸探针。而后将大量经扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子的待测DNA样品与之杂交,若两者存在至少一个碱基的差异时,即可产生杂交结果即荧光信号值的差异。以此来判断待测样品与芯片上的哪一个探针完全配对,即可得出待测样品特定位点的碱基序列,从而判断是否存在突变及突变位点和类型。该法
本文标题:实验33生物芯片的点样制备及检测核酸多态性
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