小曲米酒菌种的保存方法

根霉和酵母菌种保藏技术很多袁但原理基本一致袁即采用低温尧干燥尧缺氧尧缺乏营养尧添加保护剂或酸度中和剂等方法袁挑选优良纯种袁最好是它们的休眠体袁使微生物生长在代谢不活泼袁生长受抑制的环境中遥常用的方法有院蒸馏水悬浮或斜面传代保藏曰干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏曰超低温或在液氮中冷冻保藏等方法遥根据小曲米酒的生产情况袁斜面传代保藏法用的最多遥具体的做法是院根霉用察氏培养基袁而酵母菌用马铃薯葡萄糖培养基遥培养基配制1尧察氏培养基的配制渊1冤培养基成分蔗糖3gFeS040.001gNaN030.3g琼脂渊1.5-2冤gK2HP040.1g蒸馏水100mlKCl0.05g自然pHMgSO4窑7H2O0.05g渊2冤配制方法淤称量及溶化量取所需水量约2辕3左右加入到烧杯中袁分别称取蔗糖尧NaNO3尧K2HP04尧KCl尧MgSO4遥依次逐一加入水中溶解遥按每100mL培养基加入1mL0.1豫的FeS04溶液遥于定容待药品全部溶解后袁将溶液倒入量筒中袁加水至所需体积遥盂加琼脂加入所需量琼脂袁加热融化袁补足失水遥榆分装尧加塞尧包扎遥虞高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min遥2尧马铃薯葡萄糖培养基的配制渊1冤培养基成分马铃薯20g葡萄糖2g琼脂渊1.5-2冤g水100ml自然pH渊2冤配制方法淤配制20豫马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g袁切成小块袁加水1000mL遥80益浸泡lhr袁用纱布过滤袁然后补足失水至所需体积遥100Pa灭菌20min遥即成20豫马铃薯浸汁袁贮存备用遥于配制时袁按每100mL马铃薯浸汁加入2g葡萄糖袁加热煮沸后加入2g琼脂袁继续加热融化并补足失水遥盂分装尧加塞尧包扎遥榆高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min遥培养基配制完毕应即时分装,否则琼脂凝固,无法分装,一级种最好用玻璃试管;要安装好分装装置,常用玻璃漏斗套接乳胶管和尖嘴玻璃接液管,乳胶管上配以止流夹遥分装时左手抓握2耀3支试管,右手控制接液管插入试管,注入培养基,装培养基量为总试管容量的1/5遥分装时应注意不要将培养液沾到试管管口,避免将来发生污染遥若有沾粘,则应用干净纱布及时擦净遥分装的试管直接加棉花塞封口,棉花应用普通棉花,不能用脱脂棉,棉花塞起到过滤空气的作用,不宜过松或过紧,以封口后手持棉塞轻轻摇动试管不脱落,且旋转拔出顺利为度遥棉塞外观要求光滑,不能塞过浅或过深,否则造成操作困难遥一般分装好的试管应当天灭菌,使之呈无菌状态,以免杂菌自繁,造成培养基变质,酸败遥灭菌时将试管扎成捆,用牛皮纸或其它防潮纸将整捆试管的棉塞包好,不要摆得太挤,以免妨碍空气流通,灭菌物品也不要接触压力锅的内壁袁蒸汽缓慢升温袁以小曲米酒菌种的保存方法刘殿英60全部空气排出时的温度/益为计时遥趁热取出试管,斜卧放置,使之自然冷却,凝固成斜面,斜面为试管长的1/2,冷却后即成斜面培养基遥每批培养基灭菌做成斜面后袁最好取出几支放入37益温箱培养24h,经检查若无菌落生长,即可进行接种工作遥苗种保藏1尧斜面接种取新鲜固体斜面培养基,分别做好标记(写上菌名,接种日期),然后用无菌操作方法,用接种环沾取少量待接菌种,然后在新鲜斜面上野之冶字形划线,方向是从下部开始,一直划至上部遥注意划线要轻,不可把培养基划破遥接种后渊28-30冤益恒温培养,根霉菌培养至孢子成熟方可取出保存遥酵母菌一般培养渊36-60冤h斜面长好后,可直接放入4益冰箱保藏遥为防止棉塞受潮长杂菌,管口棉花应用牛皮纸包扎,或换上无菌胶塞,亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞遥此方法菌种一般可保存2耀6个月遥此法的缺点是容易变异,污染杂菌的机会较多遥生产中为了避免移种多次产生变异袁一般均是斜面传代保藏法和液体石蜡保藏法并列进行袁起到双保险的作用遥2尧液体石蜡保藏法液体石蜡灭菌在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,12l益湿热灭菌30min,然后于40益温箱中放置l4d或置于渊105耀110冤益烘箱中lh,以除去石蜡中的水分,备用遥接种培养同上述遥加液体石蜡用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上,加入量以高出斜面顶端约1cm为宜遥保藏可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞遥将试管直立放置于4益冰箱中保存遥利用这种保藏方法一般可保存近两年的时间遥注院液体石蜡保藏法菌种使用前要先做恢复培养遥用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种,在试管壁上轻靠几下,尽量使油滴净,再接种于新鲜培养基中培养.由于菌体表面粘有液体石蜡,生长较慢且有粘性,故一般须转接2次才能获得良好菌种遥上述方法简单易行袁且不要求任何特殊的设备遥是最常用的方法遥当然此方法易随着菌种保藏时间的延长和菌种的多次转接传代袁菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续袁也可能发生变异遥变异有正变渊自发突变冤和负变两种袁其中负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化遥常见的菌种退化现象中袁最易觉察到的是菌落形态尧细胞形态等多方面的改变袁如菌落颜色的改变袁畸形细胞的出现等曰菌株生长变得缓慢袁产孢子越来越少直至产孢子能力丧失袁如在斜面上多次传代后产生野光秃冶现象等袁从而造成生产上用孢子接种的困难曰还有菌种的代谢活动袁代谢产物的生产能力明显下降遥所有这些都对发酵生产均不利遥因此袁为了使菌种的优良性状持久延续下去袁菌种必须做复壮工作遥即在各菌种的优良性状没有退化之前袁定期进行纯种分离和性能测定遥菌种复壮退化菌种的复壮可通过纯种分离和性能测定等方法来实现袁一种方法是从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体袁以达到恢复菌种的原有典型性状遥另一种方法是在菌种的生产性能尚未退化前就经常而有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作袁以达到菌种的生产性能逐步有所提高遥所以这实际上是一种利用自发突变不断从生产中进行选种的工作遥具体的菌种复壮措施如下院1尧纯种分离采用平板划线分离法尧稀释平板法或涂布法均可遥通常我们选用平板划线分离法较方便遥方法是院将培养基熔化后自然冷至45益时按无菌操作要求,在火焰旁操作倒平板遥待平板凝固后袁使用接种环,从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样,在平板中划线分离,划线的方法多样,目的是获得单个菌落,每次划线后要烧接种环,然后再划下一区遥于渊28耀30冤益中恒温培养渊3耀5冤d.观察生长的菌落,先借用显微镜把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来袁并仿生产工艺原料尧条件培养试产遥通常在生产中袁我们是以糖化力尧发酵力确定考察菌种的生产能力的遥2尧性能测定渊1冤糖化力的测定院61淤先制备曲子浸出液称取相当于10.0g绝干样品袁置于500mL烧杯中遥根据测得的曲样水分从表中查得应加水量袁将水的温度调到35益袁用量筒量取加入盛有曲样的烧杯中袁再加入20mL醋酸钠缓冲液袁充分搅匀袁在35益水溶中浸出1h渊在浸出过程中每隔15min左右搅拌一次冤袁用脱脂棉过滤即得遥于糖化于100mL烧杯中袁加1.6%可溶性淀粉25mL,置35益水浴锅内,保温15min,加入曲子浸出液5mL,迅速摇匀记时,并立即吸出5mL混合液注入预先盛有费林氏甲尧乙液各5mL和水20mL的三角瓶中,按下述方法定糖遥将烧杯中余下的混合液,继续在35益水浴中正确糖化30min后,立即吸出5mL糖化液注入另一盛费林氏甲尧乙液各5mL和水20mL的三角瓶中,按下述方法定糖遥盂定糖上述分别加有糖化前后混合液的费林氏液袁分别用0.25%葡萄糖按廉-爱浓法滴定,滴定方法如下:预备试验:将上述已有试样的盛有费林氏液的三角瓶,置石棉铁丝网上,用电炉加热,待沸腾后用滴定管逐渐滴加0.25%葡萄糖液遥滴定时应保持试液沸腾,待兰色即将消失时,滴入0.5%次甲基兰二滴,继续滴定至兰色消失,呈现鲜红时为终点遥以上滴定过程应于4min内结束遥正式试验:于上述加有试样及费林氏液的三角瓶中,加入少于预备试验所消耗糖液量1mL的0.25%葡萄糖液,置石棉铁丝网上,用电炉加热,使其在渊2-3冤min内达到沸腾,立即加入次甲基兰2滴,继续保持沸腾2min后再以0.25%葡萄糖液滴定至兰色消失呈现鲜红色时为终点袁自沸腾后加指示剂开始至滴定终了,总时间不得超过3min遥榆计算:糖化力(毫克葡萄糖/克曲小时)={(A-B)X0.25/100X1000X30X60}辕0.25X5X30A院糖化前样品消耗葡萄糖液mL数B院糖化后样品消耗葡萄糖液mL数0.25/100:滴定用葡萄糖浓度1000:克换成毫克数30:糖化混合液总毫克数60:每小时60分30:糖化时间30分0.25:5mL曲子浸出液内曲子的克数渊2冤发酵力的测定通过测定发酵过程中生成二氧化碳的量可以判断和比较其发酵力遥15毅B忆X渊7Be忆冤浓度曲糖液院大米1份加水5份遥蒸煮渊1-2冤h袁呈糊状袁冷至60益袁加入原料量的15%曲袁补加60益的温水1份袁搅拌均匀袁在60益糖化渊3-4冤h袁用碘液试之不呈兰色反应袁再加热到90益袁用白细布过滤袁得滤液备用遥测定方法淤量取15毅B忆X浓度的曲糖化液150mL袁加入250mL的发酵瓶中袁配上棉花塞袁包好油纸袁记下液面高度袁加用油纸包发酵栓遥二者同时放入蒸气灭菌锅在1kg/c㎡下杀菌30min遥于冷落至25益左右袁在无菌条件下袁接入粉碎曲粉0.5g遥在发酵栓中注入5N硫酸10mL遥盂用石蜡封存发酵瓶塞袁用布擦干瓶外壁袁置瓶于1/1000g袁并在感量工业天平上称重袁记下读数W1克遥榆移发酵瓶于25益保温箱中袁发酵48h遥虞取出发酵瓶袁轻轻摇动发酵瓶使二氧化碳尽量逸出遥在上述同一台天平下称重袁记下读数为W2g计算院二氧化碳重=W1-W2取糖化力尧发酵力好的菌种用于菌种的传代遥我们用上述方法培菌袁一直顺利正常生产袁取得了较好的预期遥总而言之袁虽然菌种保藏法多种多样袁但对于小曲米酒生产来说袁斜面保藏法加之液体石蜡保藏法并用袁是能符合生产需求的遥如果再能常年不懈认真地做菌种复壮袁是完全能为正常生产提供较好的菌种环境的遥（作者单位：厦门国贸泰达物流有限公司）62