DNA的分离、提取和纯化技术-WL

DNA的分离、提取和纯化技术营养与食品卫生学专业王亮DNA的理化性质及特点一物理性质1、形态DNA为白色纤维状固体（通常溶于TE缓冲液或水）。2、溶解性溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；DNA在水中呈粘性胶体溶液。在酸性溶液中DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。核酸既含有酸性的基团，又含有弱碱性的基团，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的pH值而改变。3、两性解离利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在紫外区260nm和280nm处有强的吸收峰。在260nm紫外线下，1OD（光密度值）相当于双链DNA浓度为50µg/ml；单链DNA为40µg/ml。因此可根据核酸溶液的OD值，计算核酸样品的浓度或含量。对于纯的DNA，可以通过A260/A280值来判断其纯度。纯的DNA：A260/A280=1.8二紫外吸收性质DNA的特点（1）DNA（或RNA）是水溶性的。（2）嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系（3）从核酸的分子结构上看，核酸是两性电离，既带正电荷，又带负电荷。（4）DNA在细胞中存在部位不同（细胞核、线粒体、质粒）。（5）DNA空间构象不同，电泳时迁移率不同。（6）根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针。（7）DNA的双螺旋结构。DNA提取的方案：应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，基因组DNA的提取方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。DNA的提取方案DNA提取、纯化的方法（1）酚抽提法（2）甲酰胺解聚法（3）玻璃棒缠绕法（4）异丙醇沉淀法（5）以及适用于小样品量DNA提取的试剂盒等大多数核酸提取与纯化的方法包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。不同的方法之间主要是步骤与技术的差异，原理基本一致。最经典的最常用试剂盒提取DNA实验原理：试剂盒提取DNA的基本原理是用细胞裂解液CL、缓冲液FG和蛋白酶K，破坏、消化细胞，用异丙醇和乙醇沉淀DNA，最后收获DNA。试剂盒提取DNA的基本步骤细胞破碎、裂解细胞核酸与其他大分子物质分离核酸纯化酶处理所用器械与设备1.磷酸盐缓冲液（PBS）：用于漂洗样本2.细胞裂解液CL：裂解细胞、破坏细胞3.蛋白酶K与缓冲液FG：消化细胞、缓冲溶液pH值、抑制DNA聚合酶活性、破坏降解RNA4.异丙醇：沉淀DNA5.70%乙醇：漂洗DNA6.缓冲液TE：溶解DNA试剂及其作用样品前处理(1)从低温冰箱中取出事先采集好的血样(2)将血细胞放入研磨器中研磨。(3)加入PBS缓冲液，将样本转移13ml离心管中，5400rpm，20min，4度离心，弃上清。(4)用1mlPBS将离心沉淀物转移至1.5mlEP管中，5400rpm，3min，4度离心，弃上清。（1）若不能马上进行DNA提取，可将样本封存贮存于－20℃冰箱中。（2）研磨均匀，没有团块（3）离心时注意配平注意事项DNA提取步骤1．消化向上述处理好的样品溶液中，加入细胞裂解液CL，颠倒混匀数次（目的：细胞破裂，使蛋白、核酸释放）。12000rpm，1min，弃上清。将离心管倒置在吸水纸上。2．缓冲液FG与蛋白酶K向样品中加入缓冲液FG与蛋白酶K的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，混匀非常重要，充分的混匀有利于将蛋白质等大分子物质与蛋白酶K接触。3．水浴65度水浴10min，其间颠倒数次。4．加入异丙醇颠倒充分混匀至出现丝状或簇状DNA。12000rpm，5min，弃上清。倒置在吸水纸上。5．加入70%乙醇，涡旋振荡5秒钟，12000rpm，2min，弃上清。重复操作两次。倒置在吸水纸上，至少5min。空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5min）6.加入缓冲液TE，低速涡旋5s，65度加热10min-1h，溶解DNA，其间弹数次助溶残液大分子物质混合液混合液细胞裂解液CL混合液离心、弃上清缓冲液FG与蛋白酶K沉淀生成异丙醇DNA70%乙醇缓冲液TE7.样品测定在260nm紫外线下：1OD＝50µg/ml（双链DNA）1OD＝40µg/ml（单链DNA或RNA）根据A260/A280比值，可判断所提取核酸（DNA）的纯度:DNA纯度比较理想的比值是1.8。提取的DNA溶液的A260/A280比值高于1.8，说明有RNA的污染；低于1.8或1.75，则认为是蛋白质或酚污染。本方法的注意事项：1）缓冲液FG与蛋白酶K现用现配，加入到样本以后立即涡旋2）乙醇的残留会影响后续的反应（酶切、PCR等）3）过分干燥DNA沉淀会影响DNA的溶解核酸提取的原则:1.保证核酸一级结构的完整性。2.排除其他分子的污染，即纯度要高。核酸纯化应达到的要求：1.核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；2.其它生物大分子的污染应降低到最低程度；3.排除其它核酸分子的污染。核酸制备的一般原则注意事项1.尽量简化操作步骤，缩短提取过程。2.减少化学因素对核酸的降解。3.减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温4.防止核酸的生物降解。1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题二：DNA降解原因对策1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少原因对策