第3章 消毒与灭菌

1第三章消毒与灭菌第一节物理因素对微生物的影响第二节化学因素对微生物的影响第三节生物因素对微生物的影响第四节微生物的亚致死性损伤及其修复2微生物的生命活动极易受外界环境条件影响。了解外界环境因素对微生物的影响，以便控制外界因素，达到利用或消灭微生物的目的。本章着重介绍物理、化学、生物学因素对微生物的抑制或杀灭作用以及消毒灭菌方法。介绍几个基本概念。3杀菌作用(bacteriocidicaction):指某些物质或因素具有的杀死微生物的作用。抑菌作用(bacteriostaticaction):指某些物质或因素所具有的抑制微生物生长繁殖的作用。抗菌作用(antibioticaction):指某些药物所具有的抑制或杀灭微生物的作用。4灭菌(sterlization)指杀灭物体中所有微生物（包括芽孢和孢子）的方法。消毒(disinfection)指杀灭物体中病原微生物的方法。消毒只要求达到消除传染性的目的，而对非病原微生物及其芽孢、孢子并不严格要求全部杀死。用于消毒的化学药品叫消毒剂或杀菌剂。5防腐(antisepsis)指阻止或抑制微生物生长繁殖的方法。用于防腐的化学药品叫防腐剂或抑菌剂。无菌(asepsis)指在一定空间内没有活微生物的状态。防止任何微生物进入动物机体或物体的方法，叫无菌法。以无菌法进行的操作称无菌技术或无菌操作。以无菌技术剖腹产取出分娩胎儿，并在无菌条件下饲喂的动物，称无菌动物。SPF动物：以无菌方法取出，饲养在相对封闭的环境中，动物明显健康，无规定疫病病原。6第一节物理因素对微生物的影响对微生物影响较大的物理因素包括：温度、辐射、干燥、声波、微波、滤过等。一、温度不同温度对微生物生命活动呈现不同的作用。适当的温度有利于微生物的生长发育，温度过高或过低都会影响微生物的新陈代谢和生长发育，甚至使之死亡。71.低温大多数微生物对低温具有很强的抵抗力。当微生物处于最低生长温度以下时，其代谢活动降低到最低水平，生长繁殖停止，但仍可长时间保持活力。常在低温下保存微生物种。温度愈低病毒存活的时间也愈长。也有些细菌如脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等对低温特别敏感，在冰箱内保存比在室温下保存死亡更快。8冷冻保存动存微生物种时，必须迅速降低温度，起用时也应迅速融化。防止胞浆水分形成冰晶，破坏胞浆胶体、胞浆膜和细胞壁。反复冷冻与融化对微生物具有很大伤害，应尽力避免。为了减少细菌在冷冻时的死亡，可于菌液内加入10％左右甘油、蔗糖、脱脂乳或5％二甲基亚砜作为保护剂。9冷冻真空干燥（冻干）法是保存菌毒种、疫苗、补体、血清等的良好方法，可保存微生物及生物制剂数月至数年不失活。其原理是迅速冷冻，不形成冰晶，同时抽真空让固体冰中的水分子升华除去，最后在真空状态下对玻璃容器严密封口。。10在低温状态下真空抽去水分用途：保存菌种冷冻真空干燥法：11122.高温高温对微生物具有致死作用，常用于消毒和灭菌。用高温处理微生物时，可对菌体蛋白质、核酸、酶系统等产生直接破坏作用，热力可使蛋白质中的氢键破坏使之变性或凝固，使双股DNA分开为单股，受热而活化的核酸酶使单股的DNA断裂，导致菌体死亡。13高温灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两类，在同一温度下，后者效力比前者为大，这是因为湿热传导性好、穿透力强灭菌效力大。湿热中菌体蛋白较易凝固。蛋白质含水量愈高，凝固所需的温度愈低;其次湿热的穿透力比干热强;而且蒸汽可以释放大量潜热，可迅速提高被灭菌物体的温度。14热力灭菌法高温杀灭细菌焚烧----最彻底的灭菌方法烧灼----直接用火焰灭菌方法干烤----加热160-180℃2小时15（1）干热灭菌法包括火焰灭菌和热空气灭菌两类。火焰灭菌法是以火焰直接烧灼杀死物体中微生物的方法。分为灼烧和焚烧两种。热空气灭菌指利用干热灭菌器以干热空气进行灭菌的方法。用于耐高温物品。灭菌条件：160℃维持l-2h，才能杀死所有微生物（芽孢、孢子）。16高压蒸汽灭菌法最有效的灭菌方法121℃20~30分钟煮沸消毒法水煮100℃5分钟(繁殖体)~2小时(芽胞)流通蒸汽消毒法巴氏消毒法间歇蒸汽灭菌法水蒸汽100℃15~30分钟(繁殖体)反复多次流动蒸汽间歇加热灭菌较低的温度（61℃30分钟）杀灭致病菌17（2）湿热灭菌法有煮沸灭菌、巴氏消毒、流通蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌几种。煮沸灭菌煮沸10-20min可杀死所有细菌繁殖体，芽抱常需煮沸1-2h才被杀死。手术器械、注射器、针头及食具等可用此法。巴氏消毒法以较低温度杀灭液态食品中病原菌或特定微生物，尽量保持其营养成分和风味的消毒方法。主要用于葡萄酒、啤酒、果酒及牛乳等食品的消毒。18巴氏消毒法具体方法有三种低温维持巴氏消毒法（LTH）63-65℃30min；高温瞬时巴氏消毒法(HTST)71-72℃15s；超高温巴氏消毒法(UHT)132℃1-2s。消毒后均须迅速冷却至10℃以下，促进细菌死亡，称为冷击法。这样可进一步促使细菌死亡，也有利于鲜乳等食品马上转入冷藏保存。超高温巴氏消毒的鲜乳在常温下，保存期可达6个月。19流通蒸汽灭菌法是利用蒸汽在流通蒸汽灭菌器内进行灭菌的方法，100℃维持30min。间歇灭菌法：100℃维持30min，37℃温箱过夜，连续进行3次灭菌和2次保温，达到完全灭菌目的。用于不耐高温的培养基的灭菌。20高压蒸汽灭菌法即用高压蒸汽灭菌器进行灭菌的方法。是应用最广、最有效的灭菌方法。原理给高压蒸汽灭菌器加水、放入被灭菌物品、密闭、加热，蒸汽产生压力，随压力的增大水的沸点升高，温度也升至100℃以上，以提高灭菌的效果，缩短灭菌时间。灭菌条件常用1.02kg／cm2（每平方英寸15磅）的压力，在12l.3℃温度下，维持15-20min，即可杀死所有微生物，达到完全灭菌的目的。常用于如培养基、溶液、器皿、器械、敷料、橡皮手套、工作服和小实验动物尸体等的灭菌。灭菌注意须充分排除灭菌器内原有的冷空气。21湿热灭菌与干热灭菌的比较同一温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果好原因1、湿热中细菌菌体蛋白较易凝固2、湿热的穿透力比干热大3、湿热的蒸汽有潜热22二、辐射包括电磁波辐射和粒子辐射，对微生物作用为：电离辐射和非电离辐射。非电离辐射包括可见光、日光、紫外线。1.可见光指在红外线和紫外线之间，肉眼可见的光线，波长400-800nm。可见光线只有微弱的杀菌作用。2.阳光直射日光有强烈杀菌作用，是天然杀菌因素，紫外线是日光杀菌作用的主要因素。许多微生物在直射日光下，半小时到数小时即可死亡。芽抱的抵抗力强，经20h才死亡。233.紫外线紫外线中波长200-300nm部分具有杀菌作用，其中以265-266nm段的杀菌力最强，这与DNA吸收光谱范围一致。常用的紫外线杀菌灯波长为253.7nm，杀菌力强而稳定。缺点紫外线的穿透力不强，即使是很薄的玻璃也不能透过，所以只用物体表面消毒。用途微生物实验室、无菌室、手术室、传染病房、种蛋室等的空气消毒。24原理紫外线照射后，DNA分子吸收约260nm紫外线，使同一条DNA链上相邻胸腺嘧啶产生共价结合成二聚体，影响DNA复制与转录，引起致死性突变而死亡。此外，紫外线可使空气中分子氧变为臭氧，臭氧放出氧化能力强的原子氧，呈现杀菌作用。剂量与诱变育种紫外线的杀菌作用随照射量的增加而加强。若紫外线照射量不足以致死细菌，则可引起核酸的部分改变，使其发生突变。因此，紫外线照射也是一种有效的诱变方法。254.电离辐射——包括高速电子、X射线和γ射线杀菌机理产生游离基，破坏DNA。杀菌作用X射线（波长0.06-13.6nm）、γ射线(波长0.00l-0.4nm)的电离辐射微弱。α与β射线的电离辐射作用较强，有抑杀菌作用。用途一次性医用塑料制品的消毒食品的消毒不破坏其营养成分26三、干燥和渗透压作用微生物在干燥的环境中失去水分，新陈代谢障碍，菌体蛋白变性，逐渐死亡。微生物对干燥的抵抗力差异很大。巴氏杆菌、嗜血杆菌、鼻疽杆菌等在干燥的环境中仅能存活几天，而结核杆菌能耐受干燥90d。细菌的芽孢对干燥有强大的抵抗力，如炭疽杆菌芽孢在干燥条件下可存活数十年。霉菌的孢子对干燥也有较强的抵抗力。用途微生物在干燥环境中不能生长繁殖，常用干燥法来保存食品、饲料、谷类、皮张、药材等。利用高浓度的盐水或糖水保存食品，高渗溶液吸取菌体水分，造成生理干燥而抑菌。27四、超声波频率在2万-20万hz的声波称为超声波。细菌和酵母菌在超声波作用下于几十分钟内死亡。超声波处理虽可使菌体裂解死亡，但往往有残存者，小型病毒、芽抱对超声波有抵抗力。又因超声波费用颇大，故末应用于消毒灭菌。目前主要用于裂解细胞，提取细胞组分，研究其抗原、酶类、细胞壁的化学性质以及从组织内提取病毒等。28五、微波从几百兆赫至几十万兆赫频率的无线电波称为微波。微波灭菌，主要是利用微波的加热作用完成（交变电场，分子旋转振动、分子相互作用产生摩擦力，分子克服摩擦力产生热量，使物品升温，起加热灭菌作用）。用途这种灭菌法，需时短、加热均匀。可用于非金属医药用品等的灭菌。29六、滤过通过物理阻留作用将液体或空气中细菌等微生物除去以达到除菌目的的方法。滤菌器含有微细小孔0.22微米,只允许液体或气体通过，而大于孔径的细菌等颗粒不能通过。30用途液体培养基和药物除菌。糖培养液、特殊培养基、血清、毒素、抗毒素、抗生素、维生素、氨基酸等不能加热灭菌的液体常用滤器过滤除菌。病毒液分离除菌用于病毒分离。空气净化除菌超净工作台、无菌隔离器、无菌操作室、实验动物室以及疫苗、药品、食品等生产中洁净厂房的空气过滤除菌。31滤菌过程32第二节化学因素对微生物的影响许多化学药物能抑制或杀死微生物，已广泛用于消毒、防腐及治疗疾病。防腐消毒剂用于杀灭体外病原微生物的化学药物称为消毒剂；用于抑制微生物生长繁殖的化学药物称为防腐剂或抑菌剂，消毒剂在低浓度时只能抑菌，而防腐剂在高浓度时也能杀菌，它们之间并没有严格的界限，统称为防腐消毒剂。化学治疗剂用于消除宿主体内病原微生物或其他寄生虫的化学药物。33二者区别消毒剂在杀灭病原微生物的同时，对动物体有损害作用，用于环境的消毒；化学治疗剂对宿主和病原微生物具有选择性，它们能阻碍微生物代谢某些环节，使其生命活动受到抑制或使其死亡，而对宿主细胞毒副作用甚小。34一、消毒剂的种类及其应用消毒剂的种类很多，一般可根据用途与消毒剂特点选择使用。理想的消毒剂杀菌力强、无腐蚀性、能长期保存、对动物毒性很小、无残留污染、价格低等。35消毒剂的分类及作用机制（1）使菌体蛋白质变性如酚类、醇类、重金属盐类、酸碱类、醛类；（2）损伤胞浆膜如酚类(低浓度)、表面活性剂、醇类等脂溶剂；（3）干扰细菌的酶系统和代谢如氧化剂、重金属盐类(低度)；（4）改变核酸功能如染料、烷化剂等。36二、影响消毒剂作用的因素消毒剂细菌环境种类浓度作用时间菌龄种类有机物温度酸碱度371.消毒剂的性质、浓度和作用时间绝大多数消毒剂在高浓度时杀菌作用大，例外的有70%乙醇或50%-70%异丙醇的消毒效果最好。消毒剂在一定浓度下，对细菌的作用时间愈长，消毒效果也愈强。2.微生物的种类与数量同一消毒剂对不同种类和处于不同生长期的微生物的杀菌效果不同；微生物的数量越大，所需消毒的时间就越长。383.温度温度升高可增强消毒剂的杀菌效果。温度每增高l0℃，重金属盐类的杀菌作用约增加2～5倍，石炭酸的杀菌作用约增加5～8倍。4.酸碱度消毒剂杀菌作用受pH影响。如新洁尔灭pH9时杀菌作用强。同时pH也影响消毒剂的电离度，一般说，未电离的分子，较易通过细胞壁，杀菌效果好。5.有机物环境中有机物，可降低消毒剂效果。6.药物颉抗两种消毒剂合用时，有的能相互颉抗。如阴离子剂肥皂与阳离子剂新洁尔灭。7.其他因素湿度、穿透力、表面张力等。39第三节生物因素对微生物的影响自然界中，各种微生物之间，或微生物与动植物之间，经常呈现相互影响的作用，如寄生、共生和颉抗等现象。导致颉抗的原因有抗生素和细菌素、植物杀菌素、噬菌体等。40一、抗生素、细菌素素和植物杀菌抗生素(mlibiotics)某些微生物在代谢过程中产生的一类能抑制或杀死另一些微生物的特殊物质。如链霉