常用病原学检测

诊断学2临床病原学检查山东大学刘金玲临床病原体检查目的临床病原体检查目的:是确定感染的发生和性质，在疾病早期提供恰当的治疗方案，并采取有效的预防措施，防止感染传播造成的危害。各种不同病原体的实验诊断方法遵循以下基本原则1.正确、规范采集和运送标本。2.直接显微镜查见病原体或检出病原体抗原，借助分子生物学的方法检测病原体核酸，结合病人的病史、症状或体征，快速作出初步诊断。3.初步诊断同时，对病原体进行分离与鉴定。4.检测机体对病原体的免疫产物。5.参与临床选择抗菌药物，指导和监控微生物的治疗方案，避免耐药菌株的产生。5病原学诊断细菌学诊断病毒学诊断真菌学诊断致病菌的检验程序和常用项目直接涂片染色镜检分离培养形态特征生化试验血清学试验动物实验明确诊断初步诊断血清学诊断细菌的快速鉴定形态学检查（常规培养或特殊培养）（凝集试验、沉淀反应、免疫标记技术等）(微生物数字编码分类鉴定法、血培养自动化检测系统、核酸杂交技术、PCR技术、DNA芯片技术等）药物敏感试验7细菌感染检查检验特点•通过对标本直接显微镜检，病原菌的分离培养鉴定，病原菌的抗原检测，核酸检测和细菌感染后机体免疫应答产物的测定及药物的测定及药物敏感性试验，对细菌感染性疾病可作出及时、准确的病原学诊断。DiagnosisStrategyforBacterialInfection9革兰阳性菌(Grampositivebacteria)革兰阴性菌(Gramnegativebacteria)涂片结晶紫染色碘液媒染酒精脱色复红复染革兰染色法（GramStain）由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。1.步骤①直接涂片染色镜检适用于具有特征性形态和染色性的病原菌,如葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、抗酸染色阳性的结核分枝杆菌等。大多数细菌的形态与染色并无显著特异性，因此需要分离培养。如肠道杆菌均为G-杆菌，菌落形态亦相同。培养特征：化脓性链球菌---小而透明、溶血环。②分离培养•生化试验：如肠道杆菌进行乳糖发酵试验。•血清学试验：已知抗体测抗原或已知抗原测病人血清中相应的抗体。如玻片凝集，鉴定菌种和型。•动物试验：测定细菌的毒力、病原菌的分离和鉴定。②分离培养③血清学诊断原理：已知抗体测未知抗原进行病原菌的鉴定或用已知抗原检测患者体液中有无相应特异性抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。标本：双份血清标本，恢复期血清抗体效价比急性期升高≥4倍者方有意义。单份血清效价超过一定标准才有诊断意义。种类：凝集试验、沉淀试验、中和试验、补体结合试验。常用的血清学诊断方法类型诊断应用举例直接凝集试验伤寒和副伤寒（肥达试验）、立克次体（外斐试验）、钩端螺旋体（显微凝集试验）乳胶凝集试验检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等抗体沉淀试验梅毒（VDRL、RPR试验）补体结合试验检测Q热柯克斯体等抗体中和试验风湿热（抗O试验）ELISA广泛用于病原体的诊断和流行病学调查玻片凝集试验试管凝集试验酶联免疫吸附试验④细菌的快速鉴定API细菌数值鉴定系统PCR技术19姬姆萨染色衣原体包涵体HSV病毒被支原体感染的精子梅毒螺旋体20检测程序病毒感染的微生物学检查法DiagnosisStrategyforViralInfection23病毒感染的微生物学检查法ELISAforHIVantibodyMicroplateELISAforHIVantibody:colouredwellsindicatereactivity病毒的数量与感染性测定•蚀斑测定：准确滴定病毒感染性的方法–蚀斑（Plaque）–每个蚀斑是由一个有感染性病毒颗粒形成，称为蚀斑形成单位（Plaqueformingunit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示•50%感染量（ID50）或50%组织细胞感染量（TCID50）–不能准确地测定感染性病毒颗粒的数量乙型肝炎的病原学诊断A病毒性肝炎HepatitisVirus肠道传播肠道外传播F,TTV?其他ENANBBDC病毒性肝炎-背景传染源粪便血液/血源性物质/体液血液/血源性物质/体液血液/血源性物质/体液粪便传播途径粪-口经皮肤/经粘膜经皮肤/经粘膜经皮肤/经粘膜粪-口慢性感染否是是是否病毒性肝炎类型ABCDE基因组类型ssRNAdsDNAssRNAssRNAssRNAHepatitisBVirus•乙型肝炎的病原体•在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被HBV感染过，5%的人口为HBV慢性感染•中国：乙肝高发区，人群HBsAg的检出率达9.8%HBVvirionTheinfectiousvirioniscalledtheDANEparticle.HBVViralGenomeOrganizationHBsAgHBcAgHBeAg3200BasePairGenomeHepatocytereceptorbindngsiteHBVDNAPolymeraseProteinthattransactivatestranscriptionalpromotorsBothcomprisedofHBsAgHBVnomenclature•HBV:hepatitisBvirus•HBsAg:hepatitisBvirussurfaceantigen•HBsAb:hepatitisBvirussurfaceantibody•HBcAg:hepatitisBviruscoreantigen•HBcAb:hepatitisBviruscoreantibody•HBeAg:hepatitisBviruseantigen•HBeAb:hepatitisBviruseantibody抗原组成--HBsAg•位于病毒表面，是一种糖蛋白•4种亚型(adr,adw,ayr,ayw)–欧美国家:adw–我国汉族:adr–我国少数民族:ayw•判断HBV感染的指标之一•刺激机体产生保护性抗体即抗-HBs抗原组成--HBcAg•位于Dane颗粒核心部分和肝细胞核内，在血清中不易检出游离的HBcAg•主要成分是蛋白质•刺激机体产生抗-HBc(非保护性抗体)•在乙肝急性期、恢复期和HBsAg携带者中常可检出抗-HBc•抗-HBcIgM常提示病毒处于复制状态抗原组成--HBeAg•位于HBV的核心,是一种可溶性蛋白抗原•HBeAg和Dane颗粒出现相平行，且与DNA多聚酶在血中的消长动态相符合•血中HBeAg的出现可作为HBV复制及血清有感染性的指标•刺激机体产生抗-HBe•抗-HBe能与受染肝细胞表面的e抗原结合,通过补体介导破坏受染的肝细胞,抗-HBe的出现是预后良好的征象抗原组成--Pre-S抗原•位于HBV的外衣壳上，有两种•刺激机体产生抗Pre-S1和抗Pre-S2，能阻断HBV与肝细胞受体结合，从而起到抵抗病毒的作用•抗Pre-S1和抗Pre-S2的出现，表示病情好转，趋向痊愈传染源•患者–潜伏期–急性期–慢性期•无症状HBsAg携带者各种体液中HBV的浓度高中等低/不能检出血液精液尿血清阴道分泌物粪便伤口渗出物唾液汗液泪液乳汁血源性传播输血、注射、外科和牙科手术、针刺等剃刀、牙刷和蚊虫叮咬等母婴垂直传播宫内传播分娩时微小皮损处传播产后母婴密切接触性传播HBV传播途径•高(8%):占45%–一生感染的危险60%–婴幼儿感染常见•中等(2%～7%):占43%–一生感染的危险是20%～60%–感染存在于所有年龄组•低(2%):占12%–一生感染的危险20%–许多感染发生在成人危险组GlobalPatternsofChronicHBVInfection病原学诊断---抗原抗体检测项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)发光免疫分析(定量)反相间接血凝试验(少用)ELISA的基本原理•利用抗原和抗体特异性结合•主要的试剂–固相抗原或抗体–酶标记的抗原或抗体–酶的底物ELISA的主要方法•间接法:测定抗-HBs•夹心法：测定HBsAg和HBeAg•竞争法：测定抗-HBc•中和法：测定抗-HBe•捕捉法：测定抗-HBcIgM病原学诊断(二)---核酸检测•核酸杂交–探针•PCR–引物•HBsAg–感染的标志•Anti-HBs–既往感染/接种疫苗•Anti-HBcIgM–急性感染标志•Anti-HBcIgG–既往或慢性感染•HBeAg–急性病毒复制，有传染性•Anti-HBe–病毒不再复制•HBV-DNA–急性病毒复制，比HBeAg更准确；主要用于监测治疗反应血清学检测的临床意义HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义急性或慢性感染(大三阳)+-+-++++乙肝后期或慢性感染(小三阳)--++---潜伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢复期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接种或曾经感染过,有免疫力SymptomsHBeAganti-HBeTotalanti-HBcIgManti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100AcuteHBVInfectionwithRecoveryTypicalSerologicCourseWeeksafterExposureTitreIgManti-HBcTotalanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgressiontoChronicHBVInfectionTypicalSerologicCourse52真菌感染检查检验特点•形态学检查为检测真菌的重要手段•抗原检测适合血清和脑脊液中隐球菌、念珠菌、夹膜组织胞浆菌。•血清学诊断适用于深部真菌感染。53•菌丝、孢子小结•细菌感染的微生物学检查法病原体检查核酸的检测抗原、抗体的检测•病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜病毒的分离培养和鉴定核酸的检测抗原、抗体的检测•真菌感染的微生物学检查法直接镜检真菌的分离培养