电镜在生物医学中的应用

电子显微镜及其技术在生物医学中的应用概论吴晓英教授中南大学湘雅病理系超微结构与超微病理学电镜一、基本技术平台1.仪器：电子显微镜(electronmicroscope,简称电镜或EM)及制样设备：①透射电镜(TransmissonEM,TEM):内部结构②扫描电镜(ScanningEM,SEM):表面超微结构2.样品制备技术或电镜技术(electronmicroscopy)：超薄切片技术等3.图像识别和处理技术：诊断医师及技术员1.何为电镜？电镜是使用电子来展示物件的内部或表面结构的显微镜。观察对象：无机材料：材料、化工、采矿有机材料：生物、医学、农学电镜：实质上是一类工具，是显微镜的一种！但系大型、贵重、精密仪器,其原理、结构与光镜显著不同！2.电镜基本原理电子具有波粒二像性且其波长比可见光的波长短(1924年)，短波长能极大地提高分辨率（光镜受可见光的波长限制，其分辨率约200纳米)。高速运动的电子在电场或磁场的作用下，会发生折射，并且能被聚焦，聚焦即能成像。电子射束取代可见光成为可能—1932年电镜诞生！3.电子显微镜术的发展史a.电子显微镜学:①仪器:elcctronmicroscope电子显微镜②制样技术:elcctronmicroscopy电镜技术③图象识别和分析、处理技术3.电子显微镜术的发展史b.电子显微镜学的发展：1933-目前分三个阶段实验阶段应用阶段普及阶段提高完善发展阶段30-50年代50-60年代60-70年代70-目前58年我国生产了第一台电镜（南京光学仪器厂）1979年我校电镜室成立，购买H—600透射电镜4.电镜种类按使用目的分：透射电镜（波谱仪、能谱仪、三维重构等）扫描电镜（波谱仪、能谱仪）超高压电镜分析电镜扫描隧道显微镜原子间力电子显微镜按用途分：生物医学用电子显微镜非生物医学用电子显微镜按电子束发射方式分：非场发射：电子枪场发射：5.电镜与光镜的比较类别成像成像部件图像LM光子玻璃透镜虚象（彩色像）EM电子电磁透镜实像，荧光屏、CCD（黑白像）几百万倍，能看到原子的振动由于光的衍射，LM放大倍数到一定程度时就图像模糊，而电镜用电子照明，可更清晰。分辨率是衡量电镜性能的重要指标。人眼分辨率：约0.2毫米(mm),光镜分辨率：0.2微米(μm),电镜分辨率：0.2毫微米(nm)。光镜的计量单位是微米（μm）,电镜的计量单位为毫微米（nm）和埃。如人体红细胞的直径约为7μm；人体细胞膜的厚度约为7～10nm。细胞基本超微结构5.主要电镜技术①超薄切片技术；②负染色技术；③SEM电镜样品制备技术；④冷冻超薄切片技术；⑤电镜酶细胞化学技术；⑥免疫电子显微镜技术；⑦电镜放射自显影技术；⑧核酸大分子电镜样品制备技术；⑨电子探针；⑩电镜原位杂交技术。6.透射电镜基本构成真空系统机械泵油扩散泵真空管道、阀门供电系统电子枪电源透镜电源偏转器电路真空自动电路计算机控制电路采图统:CCD成象系统照明系统观察记录系统镜筒1979年湘雅电镜室成立，购买H—600透射电镜HitachiHT7700外观-2012年病理学新购20FeaturesofHT7700(ScreenCamera)HT7700Newoperationenvironment21不同级别操作权限23IDB(ImageDataBase)功能24IDB(ImageDataBase)功能雪旺氏瘤A型：长间距胶原(Laso体)H-7650方便的直接测量HT770025HT7700FeaturesandBenefits“Integrated”Highsensitivity/Resol.CCDNewRealtimescreencamera(fluorescentscreenfree)NewStandardCleanTMPVacuumNew“EMIP-SP”ForimagedatamanagementNewDouble-gapObjectiveLensForHighcontrast/HighresolutionswitchingKeydesign26FeaturesofHT7700(Double-gapObj.Lens双狭缝物镜，可以得到独有的低倍大视野、高对比度成像的特点)Double-gapobjectivelensPolepieceMaincoilMinilenscoilYoke1stGap2ndGap1stGap2ndGapB.Minilenscoil:OppositepolarityMagneticfieldMagneticfieldA.Minilenscoil:Samepolarity1stGap2ndGapLongerfocallengthShorterfocallength*Highercontrast*LowerMagnification⇒*Higherresolution*HigherMagnification⇒HCandHRinOneTEM拍照•CCD相机的灵敏度约比通常的光学相机高40倍。•具有更多的自动化功能，如自动聚焦、自动消像散、自动拍照等•标准就具有图像数据库功能，测长、图像过滤功能等•具有较强的扩展功能，如三维重构等•由于CCD相机是和电镜是一体，因此可以通过手动控制板或PC机来控制CCD相机。在显示器上显示的图像FeaturesofHT7700(Double-gapObj.Lens)80μmdia50μmdia20μmdia10μmdia28Obj.lensaperturesizeandcontrast染色的影响铀污染铅污染30FeaturesofHT7700(Double-gapObj.Lens)DigitalimageatthelowestHCmodemagnificationofx200Specimenarea～90μm2(Bottommountedcamera1kx1kpixel)Specimen:ThinsectionofhumankidneyDirectTEMMag.:x20090μm90μm31FeaturesofHT7700(Double-gapObj.Lens)1μmMagnification：5,000xMagnification：500x10μmSpecimen:Humankidney,Acc.Volt.:80kVApplications:HighcontrastviewingofunstainedsectionsPharmaceuticalsandCosmetics人皮肤100kV,70,000X鼠肠细胞刷状缘100kV,52,000XApplications髓神经ApplicationsBiofuels/PlantScience玉米叶片叶绿体,100kV,27,000XApplications35FeaturesofHT7700(Double-gapObj.Lens)36FeaturesofHT7700(Double-gapObj.Lens)37Tiling:ContinuousimagedataacquisitionAutoMulti-FrameAutoPanoramicImageFeatureofHT7700(IntegrationCCDCamera)Usingbothstageandimageshiftan8Kx8KimageisseamlesslycapturedAutomulti-frame&AutopanoramicimagefunctionHighlyaccuratealignmentisrealizedbycrosscorrelationimageprocessingandautomaticcontrastcorrectionMontageconstitutedby64images(8x8)RatkidneyDirectMag.:700xAcc.Volt.：80kV10mm120mm388kpixel8kpixelAutoMulti-framepanoramicimagefunctionHT7700Characteristics(AutoPanoramicImage)三、电镜及其技术在医学中的应用基础医学临床诊断发展趋势、新应用（纳米材料检测、DNA构象)1、EM在医学中的应用①在基础医学方面•a.观察细胞的亚微结构：线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器的接构及病理变化。•b.观察药物的代谢机理及对亚微结构的影响。•c.研究病毒的作用机理及作用靶。•d.探讨分子病理学的发生机制。•e.研究大分子在生理和病理条件下的作用方式。f.其它：如功能蛋白质组的亚细胞定位，纳米药物的研制等概述：在基础医学方面：细胞生物学、组织学、病毒学、病理学、分子生物学的发展中作出了巨大贡献并在继续应用中②EM及其技术在临床诊断中的应用：临床方面：已广泛应用于临床各种疑难病的诊断，如肿瘤cell来源的鉴别，血液病和肾脏病的分型诊断，病毒性疾病因诊断，支原体、衣原体的鉴别，神经系统疑难病和各种代谢性疾病的诊断。三、EM及其技术在临床诊断中的具体应用•1、电镜在肾脏疾病诊断及鉴别诊断中的应用•a、原发性肾小球肾炎的分型：毛细血管内增生性•系膜增身生性•膜性肾病•膜增生性•微小病变型、轻微病变型••b、继发性肾病：狼疮性肾炎•糖尿病性肾病•乙肝相关性肾炎•高血压肾病•c、遗传性肾病：薄基底膜病、Alport综合症•Barter综合症•d、鉴别诊断方面的应用：分型（原发性）、•鉴别：肺出血综合症•电镜观察最好每例2个以上不同病变的肾小球，还可以观察肾小管、内皮细胞、系膜细胞及上皮细胞的变化。d.EM在肾活检诊断中的应用微小病变肾病、遗传性进行性肾炎（AlportSyndrom）、良性家族性血尿（薄基底膜病）纤维样肾小球病：纤维样or微管样物质e．EM在肝活检诊断中的应用：Wilson病α—抗胰蛋白酶缺乏症胆色素代谢障碍：GilbeitS.Dubin-JohnsonS,Rotor.S卟林代谢疾病IgA肾病BM紫殿性肾炎淀粉样变Cap内增生性肾炎2、电镜在肝脏疾病诊断方面的应用•a、肝脏代谢性疾病的诊断•电镜用于肝脏疾病诊断已有30年，某些肝脏疾病的确诊必须依赖电镜。糖原累积症鞘脂处积病：Farbry：LysosomalstoragediseaseNiemann-PickGaucher脂代谢性疾病铜代谢障碍：Wilson病肝淀粉样变性体质性黄胆：GilbertDubin-JohsonROtorb、病毒性肝炎的分类3、电镜在神经、肌肉疾病诊断方面的应用•1、中枢神经疾病：如•2、周围神经系统•3、肌肉2010年2-5肌肉活检：肖美云4、电镜在血液系统疾病诊断方面的应用•1、白血病:•如毛细胞性白血病•2、海蓝氏细胞增多症5、电镜在病原微生物学中的应用•1、细菌、寄生虫•2、病毒：SARSvirus•3、弓形体•4、衣原体a.EM在Virus性、细菌性疾病诊断中的应用：Virus是讫今为止人类认识的最小生命形态。由于很小，只能EM才能对他们进行直接而病毒性疾病的诊断往往离不开EM。优点：很多病毒对长时间缺血和福尔马林固定的影响有较较强抵抗力。其结构可以不被破坏，故尸检取得已石蜡包埋的材料，也可方便应用EM找Virus。方法：活检和biopsy组织、培养cell等→超薄切片—观察。血液，体液——EM负染色技术。可观察的内容：Virus大小、形状、排列、复制、成熟过程、芽生部位、病毒包含体的特征等。粪便中的甲肝病毒负染色6、EM在肿瘤诊断中的应用•1、区别癌与肉瘤：基板、细胞连接等•2、区别连接复合体：Ca与间皮瘤鉴别•3、区别大细胞肿瘤：鳞Ca、腺Ca、神经内分必Ca、恶性黑色素瘤、组织细胞增生X症：Birbckbodylysosomalstoragedisease:淀粉样变性糖原累积病：肌肉酶缺乏7、EM在代谢性疾病诊断中的应用8、其它新应用•1、医用纳米材料的检测•2、DNA、蛋白质生物大分子的观察3、细胞鉴定当前形态学已由cell和亚cell水平发展为分子水平，电子显微学已向更细微结构—生物分子和原子水平