HLA-B27检测

PCR-SSP检测HLA-B27一、实验目的掌握HLA基因分型的原理，学习PCR-SSP基因分型方法。二、实验原理编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相应的序列特异性引物（sequencespecificprimers，SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。实验步骤PCR扩增琼脂糖凝胶电泳抽提DNAPCR扩增的基本原理①模板DNA的变性（热变性）模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR扩增体系•模版DNA•上游引物•下游引物•dNTP（原料）•缓冲体系(各种离子与水)•耐热的DNA聚合酶PolymorphismintheMHCVariation1%atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualsEachpolymorphicvariantiscalledanalleleInthehumanpopulation,over1,200MHCalleleshavebeenidentified.MHCgenesarethemostpolymorphicknownPolymorphicresiduesarelocatedintheantigen-bindinggroove—VariationinaminoacidsequenceschangestheshapeofthegrooveSchematicdiagramofclassIandclassIIMHCgenes,mRNAtranscripts,andproteinmoleculesEveryHLAallelehasitsownuniquesequencesSpecificsequenceprimer(SSP)isdesignedtobindtotheallelicsequencescomplementarilySequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCR三、实验材料和方法1、血样：0.2mlEDTA抗凝血2、红细胞裂解液3、白细胞裂解液4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimersHLA-B27检测操作流程一、DNA的提取1、取1mlRBC裂解液入血样管中混匀，裂解RBC;2、离心4000rpm2min;3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体；4、取100ulWBC裂解液入上述WBC管中混匀；5、将WBC管于60oC水浴消化20min；6、取出WBC管再于100oC，3-5min，灭活蛋白酶K；7、离心10000rpm2min。上清即为富含DNA的PCR模板。二、PCR扩增1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蜡油层）；2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min）×12×23预变性：94oC2min变性：94oC12sec复性：62℃1min延伸：72℃30sec变性：94oC12sec复性：58oC50sec延伸：72oC30sec37oC10secHLA-B27扩增程序三、电泳检测•吸PCR产物10ul加到2%琼脂糖凝胶孔内；•将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V20min后取出，观察结果。四、结果观察SpecificbandscanbeseenwithHLA-B27(+)samplesHLA分型概述•方法比较–血清学分型–细胞学分型–基因分型•应用–移植配型–疾病相关性研究–法医学