外植体的选择与培养

第三节外植体的选择与培养一、外植体的选择：种质优良植株健壮取材的最适时期适宜的大小选材第1章植物组织培养实验室构建及操作技术二、外植体灭菌1：对材料进行预处理2：材料表面灭菌：1）水洗,滤纸吸干;2)70%酒精浸30～60s;3）用灭菌剂处理;4）用无菌水冲洗.第三节外植体的选择与培养表面灭菌剂的种类较多，可选取1—2种使用。灭菌剂使用浓度(%)持续时间（min）去除的难易效果次氯酸钙9~105~30易很好次氯酸钠25~30易很好氯化汞0.1~12~10较难最好抗菌素4~50mg/L30~60中较好常用灭菌剂使用浓度及效果比较表第三节外植体的选择与培养三、外植体的接种与培养（一）接种—无菌操作定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到无菌培养基上，这一过程叫做接种。第三节外植体的选择与培养(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室；(2)接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖鞋等；(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷雾降尘，并擦拭工作台面；(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。第三节外植体的选择与培养接种前的准备工作：(1)对接种材料进行消毒；(2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟；(3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入或放在培养基表面；(4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟；(5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染；(7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。第三节外植体的选择与培养接种时的无菌操作技术：（二）外植体培养外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。第三节外植体的选择与培养培养的环境条件:温度氧气湿度光照培养室培养条件第三节外植体的选择与培养定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养。第三节外植体的选择与培养四、外植体成苗途径1、外植体→愈伤组织→根、芽→试管苗①同时长芽和根②先长芽，再长根③先长根，再长芽2、外植体→胚状体→试管苗（胚状体途径）3、外植体→根、芽→试管苗（器官发生途径）第三节外植体的选择与培养外植体愈伤组织胚状体芽、根根、芽芽芽根根试管苗外植体成苗途径：第三节外植体的选择与培养BAC(1)、直接从器官上发生(2)、从愈伤组织发生(3)、从游离的单细胞发生(4)、从小孢子发生(1)数量多(2)速度快(3)结构完整第三节外植体的选择与培养胚状体的产生途径：诱导胚状体比诱导芽的优点：五、培养过程中常出现的问题及解决方法第三节外植体的选择与培养污染褐变玻璃化现象组织培养三大难题第三节外植体的选择与培养1、污染原因细菌污染真菌污染（一）污染真菌污染2、污染的预防措施第三节外植体的选择与培养(1)减少或防止材料带菌(2)外植体灭菌要彻底(3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌(4)布质制品的灭菌(5)无菌室的消毒(6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。1、定义：是指外植体在培养中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响材料的培养。第三节外植体的选择与培养（二）、外植体的褐变①植物品种②生理状态③培养基成分④培养条件不当第三节外植体的选择与培养2、褐变的主要原因①选择合适的外植体：②合适的培养条件：③连续转移④加抗氧化剂：⑤加活性炭第三节外植体的选择与培养3、减轻褐变现象发生的措施（三）玻璃化现象1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。第三节外植体的选择与培养2、玻璃化现象产生的原因细胞分裂素浓度较高时；琼脂浓度低时；温度低、光照时间长时；气体交换不良时；培养基中无机离子种类及比例不当时。第三节外植体的选择与培养①适当控制培养基中无机营养成分；②适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度；③适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素量；④增加自然光照，控制光照时间；⑤降低培养温度，进行变温培养；⑥增加容器通风，最好进行CO2施肥。第三节外植体的选择与培养3、预防措施：第四节、试管苗驯化与移栽第1章植物组织培养实验室构建及操作技术试管苗草莓1、试管苗的生态环境：高温且恒温、高湿、弱光、无菌一、试管苗的特点第四节、试管苗驯化与移栽百合试管苗(1)生长细弱；(2)光合作用差(3)叶片气孔数目少，活性差(4)根的吸收功能弱(5)对逆境的适应和抵抗能力差第四节、试管苗驯化与移栽小麦试管苗2、特点：(与常规苗相比）二、炼苗（驯化）驯化的目的：通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合作用的能力，提高试管苗的移栽成活率。第四节、试管苗驯化与移栽三、试管苗的移栽1、直接移栽法2、常规移栽法3、嫁接移栽法第四节、试管苗驯化与移栽（一）移栽方法：四、提高试管苗移栽成活率的途径1、试管苗的生理状况：移栽壮苗2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去除细胞分裂素，有利生根，提高成活率3、无机盐浓度：适当降低4、加入少许活性炭5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子6、使试管苗从无菌向有菌逐渐过渡第四节、试管苗驯化与移栽本章小结：(1)常用的培养基：①MS培养基；②B5培养基；③White培养基；④N6培养基；⑤KM-8P培养基。(2)水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要成分。(3)配制母液。即先配成大量元素10倍液；微量元素100倍液；铁盐100倍液；有机物100倍液。(4)培养基配置、分装、高压灭菌(5)筛选培养基方法，即单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法。第1章植物组织培养实验室构建及操作技术本章小结：(6)植物培养技术：灭菌、接种、培养和驯化四个环节。(7)灭菌与消毒的方法。(8)接种程序：①植物材料表面的消毒；②切割外植体；③将外植体移人培养基。(9)培养方法：固体培养法和液体培养法。(10)接种材料的培养：①初代培养；②继代培养；③生根培养(11)试管苗驯化：注意基质、温、光、水、肥、气的综合管理。第1章植物组织培养实验室构建及操作技术第1章植物组织培养实验室构建及操作技术