第二章 免疫分子 3 细胞因子

第二章免疫分子第三节细胞因子(Cytokine，CK)一、概述人和畜禽体内有多种体液性免疫分子和细胞因子参与免疫应答活动，前者如免疫球蛋白、补体和粘附分子等，后者如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等作为免疫活性细胞间相互作用的介质，对免疫应答的发生、调节及效应等均起重要作用。细胞因子的研究晚于免疫球蛋白及补体系统，但进展非常迅速。1976年举行第一届国际淋巴因子(细胞因子)专题会议后的二十多年中，发现了许多细胞因子，已成为当今免疫学、分子生物学、生物化学及基因工程等领域中最活跃的研究课题之一。迄今为止，科学家们已从各自的研究中描绘出近百种细胞因子，但由于早期工作多限于其生物学活性并按活性特点命名，致使细胞因子的研究非常混乱。因细胞因子含量极微，用常规方法制备及纯化，难以获得足够的数量及纯度，限制了它的研究及应用。目前重组DNA时代已经到来，许多细胞因子的cDNA检验已获成功，其研究早期，将由活化的淋巴细胞分泌的生物活性物质称为淋巴因子(lymphokines,LK)，它是一类在免疫应答及炎症反应中有多种生物学活性的非免疫球蛋白分子。自第一个LK发现以来，IL-2（3、4、5、……23）、IFN-α（β、γ）、GM-CSF等，数以百计的LK(现包含在CK内)相继问世。除淋巴细胞分泌LK外，单核-巨噬细胞等也合成及分泌类似于LK的生物活性物质，如IL-1、6、8，TNF-α，G-CSF和M-CSF，通常将其称为单核细胞因子(monokines,MK)。除以上两类细胞外，骨髓和胸腺的基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生的EPO，IL-7、IFN-β等，在免疫应答和炎症反应中同样起重要作用。Cohen于1977年将LK、MK和EPO等统称为细胞因子(cytokine,CK)，它是由多种细胞产生的一类非抗体非补体能调节细胞生长分化，调节免疫功能，参与炎症发生及创伤愈合的激素样(微量而高效)、可溶性小分子多肽类物质。主要包括干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素、集落刺激因子等，其作用是以调节免疫应答为主。此外，还有多肽生长因子(polypeptidegrowthfactor,PGF)，如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素生长子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等；这些多肽生长因子类的细胞因子主要功能是促进细胞增殖，与免疫调节的关系较小。细胞因子平时在血流中的浓度极低，但在疾病状态下，或用细胞因子治疗过程中，可达较高水平，但当它们进入血液循环后，很快即被降解、灭活或清除，有效浓度又重新下降。细胞因子是免疫细胞间相互作用的调节信号，在细胞免疫和体液免疫的传入和传出支中都起作用，在传入支中活化淋巴细胞，调整淋巴细胞和其他细胞的生长和分化，籍以增强或抑制免疫应答；在传出支中能增强炎症细胞和非炎症细胞的代谢和功能。因此，细胞因子既显示了调节淋巴细胞的功能，又能增强炎症细胞排除异物的活性。细胞因子在机体内除了可以单独发挥作用外，更主要的是通过细胞因子间的相互诱生，以及产生的生物学效应间的相互影响，构成一个巨大的细胞因子网络(cytokinenetwork)系统，在免疫应答中发挥作用。二、细胞因子的研究历程大致经历了以下三个时期：(一)细胞生物学时期发现并确认细胞因子的生物学功能，建立敏感的和特异的检测方法，寻找各种产生细胞因子的细胞及高效诱生方法，也包括建立各种分泌细胞因子的T-T(二)蛋白质化学时期集中于分离、纯化和鉴定培养上清液中的某种细胞因子，阐明其理化性状。在此基础上，进行蛋白质氨基酸序列分析，靶细胞特异性受体分析；同时制备抗细胞因子的抗血清及单克隆抗体，研究细胞因子的免疫学特性。蛋白质化学研究既提供了大(三)分子生物学时期使用基因工程技术克隆各类细胞因子的基因，并在表达宿主中生产大量的重组产品。分子生物学技术将细胞因子研究引向黄金时代，借助各种细胞因子cDNA探针，人们可研究细胞因子的基因结构及其表达调控等；借助于基因工程技术，人们可获得高纯度、大量的重组细胞因子，以满足临床治疗及科研需要。三、细胞因子的生物学效应细胞因子可由多种类型的细胞合成分泌，几乎没有一种因子只由单一类型细胞产生。产生细胞因子的主要细胞包括：①免疫活性细胞类，如T细胞、B细胞、NK细胞及巨噬细胞等；②成纤维细胞类；③内皮细胞类；④其他细胞，包括基质细胞、角质细胞、星形细胞、平滑肌细胞及许多肿瘤细(一)免疫调节作用这是细胞因子最主要的功能，几乎所有的细胞因子均不同程度地参与(直接或间接的方式)(二)促进造血作用造血过程受多种因子的控制，其中各种CSF和白细胞介素均扮演重(三)参与炎症反应机体的炎症反应兼生理及病理双重效应，许多细胞因子如TNF、IL-1、IL-6、IL-8(四)抗增殖作用包括对外来致病微生物(如病毒、细菌、真菌等)及对肿瘤细胞生长的(五)神经-内分泌效应许多细胞因子如IL-1、IL-2、IL-6和TNF等可作用于下丘脑、垂体、肾上腺和性腺等。此外，细胞因子还参与伤口愈合、血骨转生、某些肿瘤生成、骨质代谢和内毒素休克等。自20世纪80年代初，α、β干扰素的cDNA克隆成功以来，已有30余种细胞因子的基因相继被克隆出来，具体见表1.7.1。四、细胞因子的特性根据细胞因子的生物活性，大致可将其分为两类：一为经典的细胞因子，包括淋巴毒素(LT或TNF-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素、白细胞介素(IL)和集落刺激因子(CSF)等，其作用以促进和抑制免疫应答为主。另一类为血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子及表皮生长因子等，其作用以促进细胞增殖为主。现仅将各种经典细胞因子的表1.7.1基因克隆成功的细胞因子名称(旧名)报告者(年)分子量(kD)干扰素(IFN)IFNα、IFNβI型Tanigchi等(1980)20IFNγⅡ型Gray等(1982)20集落刺激因子(CSF)多能(multi-)CSF(IL-3)Yang等(1987)14～28粒-单核细胞(GM-)CSFWang等(1985)14～15粒细胞(G-)CSFNagata等(1986)18～22单核细胞(M-)CSFWong(1987)34～45红细胞生成素(EPO)Jacob等(1985)36肿瘤坏死因子(TNF)TNF-α(恶液质素)Shirai等(1985)17TNF-β(淋巴毒素，LT)Gray等(1984)18白细胞介素(IL)IL1(淋巴细胞激活因子，LAF)March等(1985)17IL2(T细胞生长因子，TCGF)Taniguchi等(1983)15IL3(多能集落刺激因子，Multi-CSF)Yokota等(1984)28IL4(B细胞生长因子，BCGF)Noma等(1986)20IL5(T细胞替代因子，TRF)Azuma等(1986)13IL6(B细胞分化因子，BCDF)(1986)24IL7(淋巴生成素1)Namen等(1988)25IL8(中性粒细胞趋化蛋白，GCP)Mukaida等(1989)8IL9(肥大细胞生长增强活性因子，P40，TCGFⅢ)Yang等(1989)40IL10(细胞因子合成抑制因子，CSIF)Fiorentino(1989)18.7IL11(造血多功能调节因子)Paul(1990)23IL12(细胞毒淋巴细胞成熟因子，CLMF)Gubier等(1991)75IL13(NC30)Minty(1993)12.4IL14(高分子量B细胞生长因子,HMWBCGF)-60IL15Grabstein(1994)14-15IL16(淋巴细胞趋化因子)Center等(1994)13.4IL17-17.5IL18(γ干扰素诱导因子)OKamura(1996)18.3IL19Rosen(1999)IL20Shi(2000)IL21ParrishNovak(2000)IL22Xie(2000)IL23Oppmann(2000)(一)干扰素(interferon,IFN)最先发现的细胞因子，具有干扰病毒感染和复制的能力，故称干扰素。系Isaacs等于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时发现的。是由干扰素诱生剂作用于生物细胞后，诱导产生的一类高活性多功能的糖蛋白。1980年国际干扰素命名委员会对干扰素命名做了规定，先根据动物来源确定分类系统，再按抗原特异性分型，以α、β、γ表示，α相当过去的白细胞干扰素(Le)、β相当过去的成纤维细胞干扰素(F)，二者合称为Ⅰ型干扰素。由灭活的或活的病毒作用于致敏T细胞和NK细胞而产生的，称γ干扰素，相当于免疫干扰素即Ⅱ型干扰素。根据对干扰素基因核酸序列分析结果表明，它于5～10亿年前即存1.IFN的产生往抗凝血液中加入干扰素诱生剂如鸡新城疫病素(NDV)，随后将其置于37℃水浴中1小时，使病毒充分吸附到白细胞上，离心弃上液，留沉淀物，按抗凝血液量加入1～2倍Eagles培养液，置35～36℃旋转培养18～20小时。将上述培养物离心，弃沉淀物取上液，用6mol/L的HCl将pH值降至2.0，置4℃冰箱中灭活病毒5天，再用6mol/L的NaOH将pH值调至7.2～7.4，即为粗制α-干扰素。cDNA克隆已获成功。可应用基因工程大量生产高效价的干扰素。一个大肠杆菌可表达104个IFN分子。一立升发酵液可产生1g的IFN，其生物学活性不但与天然干扰素相似，且2.IFN的理化性质为糖蛋白，分子量2～10万，由150～160个氨基酸组成，含17种以上的氨基酸，其中的天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸含量较高，不含核酸，所以不被DNA酶或RNA酶破坏，对蛋白酶敏感，对湿度及pH值作用相当稳定，60℃1小时被破坏，-20℃具有相对的种属特异性，即由某一种生物细胞产生的干扰素，只能作用于同种生物细胞，使3.IFN的免疫学活性1mg纯干扰素约含10亿个活性单位，其活性呈多样性。其主要作用如下：(1)抗病毒作用：三型干扰素均有抗病毒作用，动物试验证明，γ型干扰素抗病毒活性远较α型低，γ和β型干扰素有相互加强抗病毒作用。干扰素虽有广谱抗病毒作用，但抑制病毒的程度，因病毒不同而千差万别，甚至同一种病毒的不同血清型对干扰素的敏感性亦不相同。干扰素作用于易感细胞，形成抗病毒蛋白，从而发挥抗病毒作用。已知抗病毒蛋白至少有三种：蛋白激酶、磷酸二脂酶和2-5A合成酶，前两种能破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质，后一种酶能降解mRNA，有的抗病毒蛋白还能抑制转录酶，阻止mRNA的形成，还有的能抑制病毒DNA和RNA干扰素是机体抗病毒感染的第一道防御系统。初次感染病毒时，原发感染的细胞中产生干扰素，虽然不能抑制感染细胞中的病毒复制，但可释放至周围细胞中，刺激这些细胞产生抗病毒蛋白质，阻止病毒增殖。在发生病毒血症数小时后，血清中即出现干扰素，并很快循环至靶细胞，抑制病毒增殖，防止病毒扩散。在恢复过程中，局部集聚大量淋巴细胞，产生(2)抗肿瘤作用：γ型干扰素抗肿瘤活性比α型和β型干扰素高100倍。干扰素的抗肿瘤作用主要表现在：①抑制肿瘤病毒的增殖，但必须连续使用干扰素，才能显示抑瘤效果；②抑制肿瘤细胞增生，其作用随肿瘤细胞的增加而增强；③干扰素能改变瘤细胞表面的性能，诱发新的抗原，从而易被免疫监视细胞识别，并加以排斥；④通过免疫调节作用，增强机体抗肿瘤能力，如激活巨噬细胞，增强NK和ADCC效应。干扰素能使NK细胞杀伤靶细胞的作用增高70%～90%，NK细胞亦能产生干扰素，其产生干扰素的量与抗肿瘤的活性呈正相关。(3)免疫调节作用：随所用干扰素剂量的不同，而对免疫呈现不同的作用。较大剂量的干扰素如106～107单位，在细胞免疫方面能抑制T细胞增殖，主要是DNA合成受阻；影响迟发型变态反应及异体组织移植排斥反应的发生；在体液免疫方面，可抑制初次抗体反应和再次抗体反应，既可抑制IgM也可抑制IgG的合成，还可抑制IgE较小剂量的干扰素对T、B细胞的功能