生物显微技术 第五章 原位杂交

原位杂交组织化学核酸分子杂交技术固相杂交:菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）斑点杂交法（Dotblot）Southern印迹杂交（Southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）液相杂交定义：特定标记的已知序列的核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对标记的探针进行检测的方法称为原位杂交。DetectionofDNAbynucleicacidhybridization分类核酸探针标记方法：1.放射性探针：32P3H35S2.非放射性探针：生物素、地高辛探针的核酸性质不同：1.DNA探针：单链DNA（Singlestranded,ssDNA）和双链DNA（Doublestranded,dsDNA）2.cDNA探针：complementaryDNAprobe3.cRNA探针：complementaryRNAprobe4.寡核苷酸探针原理探针标记：同位素标记和非同位素标记的探针（生物素标记和地高辛标记）探针与靶序列根据碱基互补配对原则特异性结合检测标记的探针：放射自显影、荧光检测和酶法检测。优点不需要从组织中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性。能够完整的保持组织和细胞的形态，能更准确地反映组织细胞的功能状态以及功能上的相互联系。应用特定的核酸序列在染色体中的精确定位。与细胞内的RNA杂交观察该基因的定位、定量表达。用特异性的细菌或病毒的核酸作为探针对组织或细胞进行杂交，以确定有无病原体的感染。原位杂交流程探针的标记取材切片:石蜡切片冰冻切片杂交前预处理杂交杂交后洗去未结合的及非特异性结合的探针探针的检测探针的标记缺刻平移法标记DNA探针DNANicktranslationDNARandomprimedlabelingRNAprobelabeling原位杂交条件的选择增强组织的通透性和核酸探针的穿透性TritonX-100消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等消化乙酰化：浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。杂交杂交的温度Tm：能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（meltingtemperature,简称）。Tm相关因素：CG含量；核酸的匹配程度；DNA探针：Tm是90℃，RNA探针：Tm是95℃。甲酰胺可降低杂交Tm：反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。高盐可降低Tm值苛刻复性温度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻复性温度：Tns=Tm–(30或35℃)Tm＝79．8一D十0.584×％GC十16×lg[Na＋]一F×(％formamine)一LD：是用来校正各种不同类型杂交体热稳定性的差别系数。DNA：DNA10DNA：RNA5RNA：RNA0％GC：杂交体中G十C碱基的百分比。[Na＋]：杂交液中单价阳离子的摩尔浓度。F：是由甲酰胺引起的Tm下降常数，在DNA：DNA、DNA：RNA和RNA：RNA杂交中，F值分别为0.65、0.5和0.35。(％formamine)：杂交液中甲酰胺的百分比浓度。L用以校正双链长度对Tm的影响。杂交体双链的热稳定性随着其长度的缩短而降低。L值可用公式计算：L＝B／I。其中B＝300十2000[Na＋](Na＋应为0.05一0.5mol)，I为双链的长度，用bp表示。杂交的温度时间：16－20小时探针的浓度：应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度。杂交后处理洗涤RNAase消化并洗涤使用地高辛标记的RNA探针的冰冻切片的原位杂交实验准备玻璃仪器的处理：洗液、碱过夜、自来水、蒸馏水、180℃灭菌6小时。塑料器皿的处理：DEPC处理药品的配制：药品专用、必要时DEPC处理载片的处理：清洁如玻璃仪器硅化处理：多聚赖氨酸处理探针的标记根据被检测基因的cDNA序列设计合成引物RT-PCR的方法得到扩增产物回收扩增产物克隆到质粒载体测序使用地高辛标记的d-UTP应用体外转录系统转录合成标记的RNA探针取材：根据需要把材料切成3-5mm的小块迅速投入，液氮中，-70ºC保存。切片：10µM，-70ºC保存室温干燥30分钟或50ºC、2min固定：4%多聚甲醛（pH9.5）室温固定1小时洗涤：1×PBS，2×3min蛋白抽提：1%Tron-100，室温20min预杂交室温15min，预杂交液：5×SSC，50%甲酰胺杂交：55ºC，16小时以上杂交液：5×SSC50%甲酰胺0.02%BSA250µg/mlTrna10%硫酸葡聚糖1µg/ml变性探针杂交后处理：•50%甲酰胺5×SSC，15min×1，55ºC•50%甲酰胺2×SSC，30min×1，55ºC•50%甲酰胺0.2×SSC，30min×2，55ºC•0.2×SSC，5min×1，室温•Buffer15min×1，室温•1%Blooking1hr室温•0.5%Blooking+碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体1：5000•4ºC过夜Buffer110min×3，室温Buffer35min×1，室温加显色液，黑暗室温静止显色。显色液：Buffer3中含0.33mg/mlNBT（氮蓝四唑）0.165mg/mlBCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐）2mMLevamisole观察出现信号后，去掉显色液，甲基绿对染照相，保存。原位杂交中注意的问题：杂交前处理要严格避免RNA酶的污染。•杂交前后的仪器、器皿、药品要分开使用。•杂交前使用的器皿、试剂严格处理。•杂交前操作带手套。实验结果的判定Northern和Southern印迹杂交法证明的方式免疫组织化学检测蛋白的表达。对照实验：阳性对照：取阳性组织做实验阴性实验：不加探针加sense探针在预杂交液和杂交液中加入sense探针课堂测验简述应用地高辛标记的RNA探针检测石蜡组织切片的原理和基本步骤