动物细胞培养概念原理

资料：烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人？取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植。1.动物细胞培养2.动物细胞融合3.制备单克隆抗体4.细胞核移植动物细胞工程常用的技术手段：是其他动物细胞工程技术的基础2.2.1动物细胞培养和核移植技术就是从动物机体中取出相关组织，将它分散成单个细胞，然后,放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。1、动物细胞培养概念：原理：细胞增殖胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（细胞贴壁生长增殖长成单层细胞。2、过程分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养加培养液组织细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和增殖；分散为单个细胞后：保证细胞所需的营养物质和细胞内有害代谢产物的及时排出。强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。至有接触抑制现象）。2、过程加培养液■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制细胞的接触抑制定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。至有接触抑制现象）。①原代培养2、过程原代培养加培养液接触抑制10代细胞10~50代分瓶传代培养胰蛋白酶原代培养无限传代（等同于癌细胞，没有接触抑制）传代培养定义：当原代培养的细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）②传代培养尝试完成动物细胞培养1、无菌、无毒的环境（对培养液和所有培养用具进行无菌处理；添加一定量的抗生素；定期更换培养液）2、营养（要与体内基本相同）葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素（合成培养基）+动物血清血浆等3、温度和PH（与动物体温和PH相近）温度36.5+0.5度，pH7.2～7.44、气体环境O2和CO2（95%空气和5%CO2）3、动物细胞培养条件离体培养的细胞对微生物和有毒物质没有防御能力4.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性4.细胞的生理、药理、病理研究培养正常或各种病变的细胞：如用于筛选抗癌药物课堂反馈练习：1、动物细胞工程技术的基础是------（）A.动物细胞融合B.单克隆抗体C.胚胎移植D.动物细胞培养2、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异B具有更强的全能性C.取材十分方便D分裂增殖的能力强3、下列属于动物细胞工程中的工具是（）A.限制性内切酶B.DNA连接酶C．胰蛋白酶D．果胶胃蛋白酶4、下列关于动物细胞培养的叙述中，错误的是（）A．用于培养的细胞大多取自胚胎或幼龄动物的器官或组织B．将所取的组织先用胰蛋白酶等进行处理使其分散成单个细胞C．在培养瓶中要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离，制成悬浮液D．动物细胞培养只能传50代左右，所培养的细胞都衰老死亡5、一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）①无毒的环境②无菌的环境③合成培养基需加血浆④温度与动物体温相近⑤需要O2，不需要CO2⑥CO2能调培养液pHA．①②③④⑤⑥B．①②③④C．①③④⑤⑥D．①②③④⑥DDCDD6、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此图回答(1)容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自___________。(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是__________，然后用酶处理，这是为了使细胞分散开来。这样做的目的是_______________.(3)培养首先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有__________等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，到这时的培养称为___________.(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用_____处理，然后配置成___________，再分装。(5)在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是_________________________。幼龄动物的器官或组织、动物胚胎用剪刀剪碎胰蛋白使每个细胞能与培养液接触葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素和动物血清原代培养胰蛋白酶细胞悬浮液细胞没有发生癌变植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖、促生长因子、动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.3、分类：胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难2、原理：动物细胞核具有全能性卵细胞黑面母绵羊白面母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂第三只母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞◆注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内妊娠、分娩体细胞核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？去核卵母细胞供体细胞电刺激使两细胞融合重组细胞重组胚胎新个体代孕母牛胚胎移植卵母细胞培养体细胞的核移植过程高产奶牛（供体）供体细胞培养（受体）供卵奶牛四、体细胞核移植技术的应用前景1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植五、体细胞核移植技术存在的问题•胚胎移植－动物幼体产出概率＜10％•克隆动物存在着健康问题•克隆动物的食品安全性问题存在争议1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合（也称细胞杂交）◆2.原理：细胞膜的流动性细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核病毒颗粒黏附细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合、形成杂种细胞意义：细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。•人们获得抗体的传统方法是?–将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体•这种方法的缺点是什么?–效率低，产量有限，纯度低，而且制备的抗体特异性差。•怎样获得单一类型的抗体？二：动物细胞融合的成功应用——单克隆抗体的制备思考单克隆抗体的制备—极富创造性的方案米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)的设想：将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。•米尔斯坦和科勒因此在1984年获诺贝尔奖。单克隆抗体制备过程筛选杂交细胞培养、检测、筛选足够数量的、能产生特定抗体的细胞群用特定的选择性培养基灭活的病毒等手段杂交瘤细胞骨髓瘤细胞B淋巴细胞体外培养注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体