肿瘤精准靶向治疗

肿瘤治疗相关基因检测2.肿瘤个体化治疗发展趋势1.肿瘤个体化治疗循环肿瘤细胞肿瘤分子诊断临床上治疗肿瘤的方法•患者对药物是否敏感？毒性是否可耐受？•患者治疗后转移复发风险有多高？个体化治疗：医学概念。应用它不仅降低并发症的发生,还降低医疗费用。肿瘤标准化治疗Ⅰ期患者：手术/化疗Ⅲ、Ⅳ期患者：放/化疗+手术局部晚期患者：手术、化疗、放疗、靶向肿瘤个体化治疗标本→基因检测→遗传特性→选择化疗/靶向药物病理分型分子分型已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体：v1、v2、v3a、v3b、v4、v5a、v5b、v6、v7检测方法：RT-PCR,FISH,PCR-测序等EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和p23带克唑替尼的靶标——EML4-ALK融合基因靶向EGFR的抗肿瘤药物类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR－TKI)作用机制：抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活性，阻断EGFR信号通路；药物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替尼（罗氏）。类别二：单克隆抗体(mAb)作用机制：与EGFR胞外区结合，阻断配体与EGFR的结合；药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗氏）。基因EGFR热点突变位点•EGFR主要突变在：外显子18，19，20，21•耐药突变：T790M靶向药物西妥昔单抗靶标——K-ras基因检测NCCN明确指出西妥昔单抗（爱必妥）用药之前须检测K-ras基因突变检测；K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗（爱必妥）中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用；中国人群中K-ras基因突变率15%！15%的病人不应该使用爱必妥！野生型突变型WorldJGastroenterol.2011November21;17(43):4779-4786.基因KRAS热点突变位点10KRAS主要突变在：外显子2（密码子12，13），3（密码子61）个体化检测平台基因突变检测——ARMS技术，测序等ARMS技术——普通PCR等位基因特异性扩增法（AlleleSpecificAmplification，ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻滞突变系统（AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS）、等位基因特异性PCR（AlleleSpecificPCR，ASPCR）等。方法：2条正向引物（针对正常DNA，突变DNA）1条反向引物2个平行的PCR反应普通PCR仪应用：对微量突变进行检测。TaqMan-ARMS技术TaqMan-ARMS探针技术基于实时PCR平台，结合了ARMS突变富集和Taqman-MGB特异性荧光检测两种技术。Taqman-MGB：针对SNP位点特异性扩增的探针，可区分一个碱基的突变。一个PCR体系中：1对引物，1条探针每个位点需要做至少两管PCR扩增！！！SNP位点检测应用检测方法/检测灵敏度100%50%5%1%0.01%耗时费用直接测序法+++++---6h低Taqman-ARMS®++++++++++++-1.5h中等焦磷酸测序法++++++--6h中等TaqmanQPCR技术+++++++/---2h中等EGFR基因突变检测方法灵敏度的比较测序技术发展历程SangerSequencing（1977）IonSemiconductorSequencing（2011）Next-GenSequencing（2005以后）IonTorrent半导体测序原理IonTorrent半导体测序平台及芯片PI芯片：sequenceexomesandwholetranscriptomes（5Gb）肿瘤类型靶向药物基因样本疗效佳的情况非小细胞肺癌易瑞沙（Iressa）特罗凯（Tarceva）EGFRKRAS手术/穿刺/胸腹水/血浆EGFR突变/KRAS野生克唑替尼EML4-ALK融合手术/穿刺/胸腹水阳性胃肠间质瘤格列卫（Gleevec）C-KitPDGFRA手术/穿刺/内镜活检/血浆C-kit第11外显子突变/PDGFR突变慢性粒细胞白血病格列卫（Gleevec）达沙替尼(Dasatinib)尼罗替尼(Nilotinib)ABL骨髓/全血无T315I突变乳腺癌拉帕替尼（Lapatinib）PI3K手术/穿刺/内镜活检/血浆野生型赫塞汀Her-2病理切片高表达/表达阳性目前成熟的肿瘤分子靶向药物敏感性基因检测基因表达量（mRNA）检测——指导个体化化疗可使标准化疗方案得到个体化应用mRNA检测主要技术特色•采用荧光定量PCR技术，采用内参比RNA作为质控对照，应用beta-actin作为内对照，定量检测检测目的基因mRNA表达水平。•适用于各种肿瘤组织检测，包括石蜡标本、穿刺标本、冰冻活检标本等。•国内采用校准RNA（CalibratorRNA）方法进行基因表达定量。23基础：5000例样本人种：中国患者样本标准：正态分布定位：精确到1%统计：p0.05Q-PCR检测基因表达数据库NCCN2012年版临床治疗指南明确指出：患者接受吉西他滨化疗前进行RRM1mRNA检测可提高治疗有效率和患者生存率。RRM1mRNANo.PatientsMedianSurvivalP1.4815.5mos0.00281.486.8mosRRM1表达与吉西他滨疗效相关的临床数据ERCC1表达与铂类药物疗效相关的临床数据ERCC1低表达患者，能从铂类辅助化疗中获益.BRCA1/2表达与铂类药物疗效相关的临床数据BRCA1过度表达•铂类耐药的预测因子•抗微管类药物的敏感因子28•低TSmRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中位生存期较长。•TS低表达的患者对培美曲赛的疗效好。TS高表达影响氟类和培美曲塞药效ShirotaYetal.JClinOncol.2001;19:4298-304TUBB3高表达对紫杉醇和长春碱类不敏感•TUBB3阳性表达是抗微管类药物敏感预测因子30STMN1表达检测意义•预后：表达水平越高，患者的生存率越低，肿瘤发生转移的风险越高。•疗效：低表达接受长春瑞滨/顺铂治疗的效果较好，中位生存期较长；STMN1高表达接受长春瑞滨/顺铂的疗效较差。ElizabethAetal.CancerRes.2002;62:6864-6869——乳腺癌患者预后指标及曲妥珠单抗治疗的靶点——胃癌曲妥珠单抗靶向治疗的靶点HER2基因检测FDA2013年关于胃癌HER2检测流程建议ASCO/CAP2013指南关于乳腺癌HER2检测推荐：IHC检测HER2蛋白表达水平FISH检测HER2基因扩增药物名称检测靶点检测内容靶向药物贝伐单抗VEGFRmRNA表达水平，1项西妥昔单抗K-ras(2项);B-raf;PIK3CA(2项)基因突变，5项EGFRmRNA表达水平，1项厄洛替尼EGFR(Exon18/19/20/21);K-ras(2项);B-raf基因突变，7项曲妥珠单抗HER-2;PTENmRNA表达水平，2项索拉菲尼PDGFRβ;VEGFRmRNA表达水平，2项伊马替尼C-kit(4项);PDGFRα(2项)基因突变，6项PDGFRβmRNA表达水平，1项舒尼替尼VEGFR;PDGFRβmRNA表达水平，2项C-kit(4项);PDGFRα(2项)基因突变，6项靶向药物敏感性解决方案药物名称检测靶点检测内容化疗药物卡铂/顺铂/奈达铂/奥沙利铂ERCC1;BRCA1mRNA水平，2项XRCC1(2项);ERCC1;ERCC2;GSTP1;GSTM1;MRP2基因多态性，7项5-Fu/卡培他滨/培美曲赛TSmRNA水平，1项MTHFR;TS;GSTP1基因多态性，3项紫杉醇/多西紫杉醇/长春瑞滨/长春新碱/多西他赛/卡巴他赛TUBB3;STMN1;TaumRNA水平，3项GSTP1;GSTM1;GSTT1基因多态性，3项吉西他滨RRM1mRNA水平，1项RRM1基因多态性，1项依托泊苷TOP2AmRNA水平，1项MDR1基因多态性，1项阿霉素/脂质体多柔比星TOP2AmRNA水平，1项MDR1;GSTP1;GSTM1;GSTT1基因多态性，4项丝裂霉素NQO1基因多态性，1项替莫唑胺MGMT,ERCC2mRNA水平，2项MGMT甲基化水平，1项MDR1基因多态性，1项卡莫司汀/司莫司汀/洛莫司汀ERCC1;ERCC2mRNA水平，2项化疗药物敏感性解决方案循环肿瘤细胞（CTC）检测1869年AustMedJ，Ashworth最早在转移性癌症患者血液中观察到。2005年NEnglJMed，Cristofanilli证实治疗前CTC数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞原发肿瘤血管生成侵润侵入血管内侵入血管外(CTC)血管内增殖(CTM)转移转移播散肿瘤细胞（DTC）微转移休眠灶循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤微栓（CTM）凋亡的CTC侵润肿瘤细胞扩增血管生成上皮－间质转化（EMT）间质－上皮转化（MET）转移到骨髓和其他器官循环肿瘤细胞（CTC）检测全球唯一一个获得FDA和SFDA认证的循环肿瘤细胞检测系统(CirculatingTumorCell)强生CellSearch系统国内注册情况白细胞Anti-CD45CD45NucleusDAPI如何鉴别出CTC?藻红蛋白(PE)变藻蓝蛋白(APC)CTCAnti-EpCAM磁珠Anti-CK-PENucleusDAPICKEpCAM在CellSearch®检测中，CTC被设定为：EpCam（上皮来源细胞表面抗原）CK-8,18和/或19（肿瘤细胞表面抗原）DAPI（细胞核染料）CD45（白细胞表面抗原）+++-CTC数量与无进展生存期和总生存期的关系•化疗后CTC数量少于阈值的患者无进展生存期和总生存期明显高于CTC数量大于阈值的患者。•化疗前后CTC数量都少于阈值的患者无进展生存期和总生存期明显高于只有一次测出CTC数量少于阈值的患者。乳腺癌阈值5，结直肠癌阈值3，前列腺癌阈值5为什么要选择使用CTC系统?唯一的标准化，自动化循环肿瘤细胞计数系统具可重复性和高敏感度系统最低检测限度：7.5ml外周血中的1个肿瘤细胞临床意义预测无进展生存期和总生存期转移性癌症的监护疗效监控复查（早于影像学发现疾病进展情况）CTC检测样本使用CellSave储存管采集静脉血液标本10ml轻轻颠倒8次，防止凝块样本室温条件(15-30摄氏度)下96小时之内接受处理接受阿霉素治疗的患者给药之后，至少需要等待7天术后15天以后样本溶血及结块不能用于CTC检测！送检样本要求肿瘤分子诊断基因表达类手术组织/活检组织/石蜡切片/蜡块基因突变/多态性类全血/手术组织/活检组织/石蜡切片CTC外周血7.5mL，专用的Cellsave管肿瘤个体化用药是发展趋势肿瘤个体化用药分子靶标及靶向药物开发的关联研究越来越多部分基因检测近年已逐步在临床推广比较完整的个体化诊疗解决方案逐步诞生结语肿瘤个体化治疗发展趋势风险预测我是否易得某种肿瘤？复发监控疗效判断治疗选择预后判断临床分期鉴别诊断早期筛查我的肿瘤会如何进展？我现在是否可能有肿瘤？我的肿瘤是什么类型的？我的肿瘤扩散了吗？我的肿瘤回来了吗？我的治疗起作用了吗？最适合我的治疗是什么？如：CtDNACTCPSACEAAFP……如：EML4-ALKHER2MSI……如：CTCCt-DNA……如：EGFRERCC1HER2……如：21基因CTC放疗敏感PAM50MSI放疗毒副……如：CTCCt-DNA……如：CTCCt-DNA……如：BRCA1/2CDH1APCMMRRET……为什么要做分子检测？肿瘤分子分型时代要到来？在美国华盛顿大学，LukasWartman医生患上了成人急性淋巴细胞白血病。Lukas的病情很快恶化，所有已知的疗法都无能为力。Ley博士的团队运用新一代测序技术，将Wartman的癌细胞与健康细胞进行全基因组重测序对比分析，同时进行R