正交试验在医药科研中的应用

正交试验在医药科研中的应用屠鹏飞北京大学中医药现代研究中心一、正交试验法的作用表1、乙酰苯胺不同磺化试验结果试验号反应温度(℃)反应时间(小时)硫酸浓度(％)操作方法收率(％)150117搅拌65250127不搅拌74350217不搅拌71450227搅拌73570117不搅拌70670127搅拌73770217搅拌62870227不搅拌67如果采用正交试验法，可归纳成表2的试验方案：表2乙酰苯胺磺化试验正交设计因子水平Ａ反应温度(℃)Ｂ反应时间(小时)Ｃ硫酸浓度(％)Ｄ操作方法150117搅拌270227不搅拌表2的试验如果全面互相搭配进行，则要做16组，如果采用正交L8(27)法,只需做8组试验，就可得出二点可信度达95％的可靠结论。•①影响收率的关键是硫酸浓度，即硫酸一定要采用27％，磺化温度如果采用50℃，则时间要采用2小时；磺化温度如果采用70℃，时间要采用1小时，不然收率就低。搅拌与否，对收率没有显著的影响。•②最优化工艺不是2号，而是4号和6号。经进一步计算，4号和6号比2号平均收率高出4.73％。•从上述实例可以看出，采用正交法，既省力，又可得出科学、可信度高的结果。二、正交试验法的基本特点•用正交法来安排试验，在于安排试验的这种正交表具备均衡分散，整齐可比特性。(一)试验均衡分散•１、因子与水平完成一项研究，或一个产品的条件叫因子(因素)。例如煮大米饭，是米、水、火三个条件参与完成的，那么米、水、火就是煮饭的三个因子(因素)。水平是指因子(因素)所处的不同状态，即试验点。例如煮饭是早米好吃，还是用晚米好吃，早米、晚米就是不同的水平，同理每公斤米加1公斤还是加1.25公斤水好，火是大火好还是文火好，都是不同的水平。如果要做煮饭试验，用正交试验法将因子和水平列成表3。表3煮饭试验的表头设计因子水平Ａ米Ｂ水Ｃ火1早米1kg大火2晚米1.25kg文火２、正交表正交表是指正交试验法中安排试验，分析试验的一种得力工具，每张正交表，都有自己的名字，并反映出表的具体内容。以L4(23)为例：表示正交的意思表示这张正交表内有四个横行，每一横行分别叫1号、2号、3号、4号。用它可以安排四组试验表示这张正交表只有两种数字，一种是1，另一种是2分别叫水平1和水平2。用它可以安排两个水平的试验表示这张正交表有3纵列，其名分别为列1、列2、列3用它最多可以安排3个因子的试验L4(23)2水平有：L4(23)、L8(27)、L12(211)……L64(263)3水平有：L9(34)、L18(37)、L27(331)………L81(340)4水平有：L16(45)、L32(48)、L64(421)表4L4(23)正交表列号试验号1231111212232124221所有正交表都具备以下两个数学性质：①任何一列，各水平出现的次数相同。②任何两列的同一横行，有序数对出现次数相同。上述两点，缺少任何一点，表就不正交了。３、均衡分散：一个整体的全面试验中，用正交表挑出来的这部分试验分布均匀，代表性强，所以只要通过这部分试验，就能反映全部试验情况。A2B2C1A1B1C2A1B2C1A1B2C2A2B2C2A2B1C2A2B1C1A1B1C187654321○●○●○●●○①任何一个面上都有二个试验点②任何一条线上都只有一个试验点③所有因子的水平一视同仁(二)数据计算简单表5金、银、铜球重量试验因子水平A铜球Ｂ银球Ｃ金球1铜甲(25g)银乙(30g)金甲(22g)2铜乙(21g)银甲(20g)金乙(34g)表6金、银、铜球重量正交试验表表头试验号A1B2C3试验结果(g)111177212279321285422163K1156162140T=304K2148142164Y=T/N=76R8/220/224/2•K：表示各因子的相同水平所对应的试验值之和。•R：表示极差。•从上述试验结果可以得出下列二点结论：•①比较R值大小，可以看出某因子在这些试验中起主要作用或起次要作用。•②比较K值大小，可以知道该因子不同水平对试验影响的程度。•μ优(A1B1C2)=(A1+B1+C2)/2-2=(156+162+164)/2-76×2=89三、正交表的应用程序•(一)单一水平正交表应用1、二水平正交表的应用例：板蓝根注射液除杂质方法试验板蓝根水煎液，用乙醇沉降，冷藏，调pH等方法去除杂质，其注射液常发生澄明度或含量不合格。用石硫醇法处理，虽然解决了澄明度问题，但含量仍不能稳定。为了摸清影响含量和澄明度的原因，将上述两种方法组成下表试验方案。表7板蓝根注射液除杂质方法试验因子水平ABC1加20％石灰乳调pH至12过滤，加5％硫酸至pH7，过滤加乙醇至含醇量达85％沉降用氨调pH至92加乙醇至含醇量70％沉降00表8板蓝根注射液除杂质方法正交试验因子水平A1B2C3试验结果11117.921226.332127.8422110.3K114.215.718.2K218.116.614.1R3.9/20.9/24.1/2最佳工艺：A2B0C12、三水平正交表的应用例、复方延胡索制剂乙醇渗漉条件的考察处方：当归、延胡索、赤芍、丹皮、栀子等12味药组成。表9因子水平表因子水平醇浓度(%)A浸泡时间(h)B收集渗漉液(ml)C渗漉速度(ml/min)160124000227024500033804860004①影响乙素提取率的主要因素是醇浓度和收集渗漉液量②浸泡时间24小时与48小时没有明显区别③渗漉速度对含量影响很小优化工艺：A3B2C3D3表10正交试验结果(L9(34))表头试号ABCD延胡索乙素总量(mg)111116.49212229.363133313.86421239.685223113.85623128.837313215.038321313.899332115.23K129.7131.2029.2135.57K232.3637.1034.2733.22K344.1537.9242.7437.42R4.812.244.511.403、四水平正交表应用例、甘草酸提取方法实验表11甘草酸提取实验水平因子因子水平溶剂用量A不同溶剂B12000.25%氯仿水22500.5%氨水330010%乙醇4600蒸馏水表12甘草酸提取正交试验表头试号A1B2345甘草酸含量×100－11111111-4.31212222-1.50313333-1.004144440.41521234-4.23622143-2.65723412-2.018243210.26931342-3.1010324313.0911331240.5912342130.6913414230.0114423143.9915432412.1416441323.26K1-6.40-11.62-3.10-1.631.19T=-4.36K2-8.632.92-2.91-0.65-3.36K31.27-0.280.151.12-2.95K49.404.621.50-3.200.76R×418.0316.244.604.324.55•结果分析：根据表12的R和K所示，列3、列4、列5是误差估计列，因为其R均小，用其Re=(R3+R4+R5)×1/3=4.17来衡量RA和RB，而RA、RB均超过Re的2倍以上，故可知因子A、B均是主要因子。取其好水平，其最优提取方法是：A4B4或A4B2。而最差提取方法是A2B1或A1B1。以试验对照，均与试验实际吻合。故结论为：•(1)从甘草中提取甘草酸，用蒸馏水、0.5%氨水比用10％乙醇、0.25％氯仿水能明显提供收率。•(2)从甘草中提取甘草酸，其溶剂用量以600ml比300、250、200ml能明显提高收率。(二)有交互作用的试验安排•“世界上的一切事物都是互相联系、互相制约的”。•我们所做试验的因子间关系也是如此。如某因子不论在其它因子的什么水平情况下，其试验值不是水平1比水平2好，就是水平2比水平1好。用正交表安排，其R值（或F值）较小者，称为该因子不与其它因子发生明显的交互作用。•反之，某一因子水平好坏是依赖于其它因子水平而定，用正交表安排，其R值（或F值）一定较大者，这种情况表明这两个因子间存在有明显的交互作用。在医药科研和病例分析中，常常会遇到这样类似的情况。•当某一药物反应温度为50℃时，反应时间用2小时，会比用1小时明显提高收率。倘若反应温度改成70℃时，而反应时间还是2小时，那么其收率就会比用1小时明显的降低。但在加催化剂用量上，无论是反应温度50℃还是70℃，或是反应时间2小时，还是1小时，催化剂用量20％的收率都明显高于用10％的。•因此，可以说“反应温度与反应时间存在交互作用，而反应温度与催化剂用量和反应时间与催化剂用量之间则不存在交互作用”。用正交表安排，前者的R（或F）值一定会比后两者大。1、如何应用正交表来考察因子间是否存在着交互作用•（1)定名•A与B的交互作用表示为：A×B•A与C的交互作用表示为：A×C•B与C的交互作用表示为：B×C这三种交互作用如果都安排在正交表上考察，照上述说法，RA×B一定大于RB×C和RA×C•(2)计算自由度用正交表安排交互作用，一对交互作用当作一个因子，但其所占正交表的列数不一定和因子所占列数完全相同，而是要看其两因子自由度乘积（即其自由度）大小来定。如二水平三因素的正交试验，如果要安排A×B，其A×B自由度即fA×B=fA×fB＝(2－1)(2－1)=1，用1列安排。原用L4(23)安排，现在增加A×B，则其所做试验次数是fA＋fB＋fC＋fA×B＋1＝5，在2水平正交表中没有做5组的正交表，于是改用L8(27)安排。在三水平四因素的正交试验中，fA×B＝(3－1)(3－1)＝4，而原来的3水平正交表每列自由度为2，故A×B不能用1列，而要用2列才能安排，如此，也不能用L9(34)安排，而要用L27(313)安排，因为fT＋1＝fA＋fB＋fC＋fA×B＋1＝(3－1)×4＋(3－1)(3－1)＋1＝13。•(3)查交互作用表L4(23)只安排了二个因子，如果A与B存在交互作用，就在另一列上反映出来，其表头设计为：因子ABA×B列号123但如果要考察三因子A×B、B×A、A×C的交互作用是否存在，就要改用L8(27)，在作表头设计时应查对其所选用正交表后面的交互作用表。方法如下：在表头设计时先查L8(27)的交互作用表，见表13。表13L8(27)交互作用表列号列号1234567(1)325476(2)16745(3)7654(4)123(5)32(6)1如果A安排在列1，B安排在列2，那么A×B安排位置就从表13中的(1)横着向右看，(2)竖着向上看，它们的交叉点是3，此3就是A×B要安排在列3。同理，B安排在列2，C安排在列4，B×C就安排在列6。A×C安排在列5。交互作用的表头设计为：因子ABA×BCA×CB×CD列号1234567•2、交互作用占一列举例例、乙酰苯胺磺化试验乙酰苯胺磺化试验，实践表明反应温度与反应时间可能存在着交互作用，因此在原来的正交试验上加A×B，总自由度加1应改为：fT＋1＝fA＋fB＋fC＋fD＋fA×B＋1＝(2－1)×4＋(2－1)(2－1)＋1＝6按此计算，仍然可以选L8(27)安排。本例是4个因子各占1列，一个A×B交互作用占1列，共计占去5列，尚有2列空出，因此表头设计应采用主效应主与交互作用混杂的设计，将A、B、C、D分别安排在列1、2、4、7，A×B安排在列3。而列5、6空着作试验误差估计。于是表头设计为：表14一列交互作用正交试验表头试号A1B2A×B3C456D7实验结果(－70)y11111111-521112222431221122141222211352121212062122121372211221-882212112-3K132-12-124-5-7T=-5K2-8-777102R11/49/419/419/43/45/49/4•试验结果分析：(1)确定主要因子：RC和RA×B较大，取其好水平C2、(A×B)2和差水平C1、(A×B)1，它