第五章 植物离体快速繁殖和脱病毒技术

第5章植物离体快速繁殖和脱病毒技术5.1植物快速繁殖技术5.2无病毒植物的培养•概念：所谓快速繁殖，就是将外植体在人工培养基和合适的条件下进行培养，以在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法。•特点：繁殖速度快；使用材料少，生产效率高，省时省工；可大量繁殖脱毒苗；利于种质资源的保存和交换等；节约空间，不受季节限制，有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。5.1植物快速繁殖技术•快速繁殖过程一般包括四个阶段，即无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根和试管苗的驯化和移载。5.1.1无菌培养物的建立初代培养：进行离体繁殖时首先必须建立的无菌培养物。需注意以下几点：（1）保证无菌：外植体、培养基、培养室无菌状态。（2）条件合适：合适的外植体；合适的培养基；适宜的培养条件。（3）技术过关：要熟练掌握无菌操作技术。（4）防止褐变：外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，将酚类化合物氧化成醌类物质，它们多呈棕褐色，会抑制其它酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。褐变的主要原因①植物种类和基因型由于多酚氧化酶活性上的差异，不同品种间的褐变现象是不同的。②取材部位和生理状态处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。③培养基成分无机盐浓度过高、细胞分裂素的水平过高等都会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。④培养条件不当如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速褐变程度。减轻褐变现象发生的方法①选择合适的外植体一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。②合适的培养条件无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度等均可以减轻材料的褐变现象。③使用抗氧化剂在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。④连续转接对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。5.1.2培养物的增殖（1）促进腋生分枝促进腋芽的形成和生长：使用外源的细胞分裂素可以打破顶端优势，促进腋芽生长，形成芽丛，经反复切割和继代培养，可短期获得大量芽。有些植物即使在含有细胞分裂素的培养基中其项端优势也不易被打破，接种的茎尖只能长成不分枝的一根枝条，此时可以用切段法（每个切段带有一个腋芽）加以繁殖。这种繁殖方式不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种遗传特性的一种繁殖方式。•（2）诱导不定芽形成不定芽：从任何除现有芽之外的器官和组织上通过器官发生重新形成的芽叫不定芽。通常采用从器官中直接产生不定芽：A有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。B在离体培养条件下，培养基中提供连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。C在许多常规方法中不能产生不定芽的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽，如柏科，松科，银杏等一些植物。•(3)诱导胚状体形成•是由植物器官、组织和细胞培养直接发生类胚结构，最后以肧状体成苗的方式。在组织培养条件下胚状体的发育过程类似于合子胚的发育：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的胚状体。•肧状体途径优点是增值率高，同时具胚根和胚芽，免去生根一步；可用于制作人工种子，便于运输和保存。缺点是肧状体成苗率低，遗传性状不稳定。5.1.3诱导生根MS、B5、White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释，它们都抑制根的发生。应将它们降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。生根培养基适当加大生长素的浓度，不用或少用细胞分裂素，生长素浓度在1-10mg/l，使用较多的是NAA，其次为IAA和IBA。培养基中蔗糖的浓度降低到1.0-1.5%，以增强植株的自养能力。培养基不宜过硬以免影响生根。为提高小植株的光合能力，可将光强度增加到3000-10000lux。5.1.4试管苗的驯化和移栽•驯化或炼苗：为了适应移栽后较低湿度和较高光强等环境条件，能顺利进行自养，必须有一个逐步锻炼和适应的过程，这个过程叫驯化或炼苗。•移栽前的练苗•移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2—3d，让试管苗接受强光的照射，或培养基中加入矮壮素等生长延缓剂等。使苗长得壮实起来，然后再开口练苗1—2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。移栽和幼苗的管理•从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，保证空气湿度达90%以上。5.1.5快速繁殖中应注意的问题（1）遗传稳定性①外植体的来源：不同种、同一种的不同品种以及同一植株的不同器官发生变异频率不同。②继代培养：继代培养的时间和次数是造成变异重要因素。③再生植株发生方式：茎芽直接增殖、外植体直接形成不定芽方式或愈伤组织诱导不定芽方式，变异率依次增强。④植物生长物质：是诱导变异的重要原因之一。•（2）玻璃化现象定义：当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。特点：外观形态有明显异常；体内含水量、矿质元素、糖类、纤维、蛋白质等基本成分含量有变化，一些酶活和内源激素含量有变化。•影响玻璃化苗发生的因素：①培养材料：材料种类和外植体不同都有影响。②环境因素：液体培养比固体培养更易玻璃化；蔗糖浓度与玻璃化呈负相关；通气不良；温度过高等都可导致玻璃化。③培养基成分：铵离子过多可致玻璃化；6-BA浓度与玻璃化呈正相关等。•控制玻璃化苗的措施：采用固体培养，提高蔗糖含量通气，适当提高光强，控制温度降低培养基中NH4+和细胞分裂素浓度其它措施月季快速繁殖5.2无病毒植物的培养•病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，造成减产、品质变劣等严重后果。如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产l0%-18%，为害马铃薯的病虫害则更多，花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值等。•无病毒苗培育的意义用组织培养方法生产无毒苗，排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。•5.2.1脱除植物病毒的方法•（1）物理方法：X射线、紫外线、超短波、热处理等。热处理，原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，在高温下，不能生成或生成病毒很少，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。①温水浸渍处理适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。②热空气处理热空气处理对休眠组织和活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室(箱)内，一般在35—40℃。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。•热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒，因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的效果。•（2）化学方法•许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有：8—氮鸟嘌呤、2—硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100μg2—硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。（3）生物方法①种子繁殖②茎尖培养脱毒法•原理：A传导抑制；B酶缺乏；C能量竞争；D抑制因子存在。方法：在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需用带有适当光源的简单解剖镜(8—40倍)。在切取外植体之前一般须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。将接种好的茎尖置于22℃左右的温度下。每天以16h2000—30001x的光照条件下培养。③微体嫁接脱毒法木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.2mm左右茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。④珠心组织培养脱毒法原理：珠心与维管束系统无直接联系。⑤愈伤组织培养脱毒法通过植物器官和组织脱分化培养诱导产生愈伤组织，经几次继代，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。病毒可能会在愈伤组织继代培养过程中消失。⑥茎圆盘培养脱毒法•5.2.2脱病毒植株的鉴定•（一）指示植物(indmatingplant)法•利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法。摩擦接种法：最早是美国的病毒学家Holmes1929年发现的。他用感染TMV的普通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦，2—3d后叶片止出现了局部坏死斑。这种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至今，嫁接法：指示植物作砧木，被鉴定植物芽作接穗。（二）免疫学方法①抗血清(antisemm)鉴定法用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。②酶联免疫鉴定法(EnzymelinkedimmunityabsorptionassayELISA)酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。•（三）电子显微镜鉴定法由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，所以只有通过电子显微镜才能分辨0.5μm大小的病毒颗粒。这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。（四）分子生物学方法具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等特点。核酸杂交技术PCR技术基因芯片技术以马铃薯茎尖脱毒培养为例图1-1脱（无）毒试管苗生产程序茎尖繁殖试管苗切断到试管薯繁殖过程图4-2不同浓度IAA与GA（A）、GA+BAP（B）互作对试管苗生长及试管薯形成的影响Fig.4-2DetailsoftheinteractionofvariousIAAconcentrationswithGA3（A）andGA3+BAP（B）onthegrowthandmicrotuberizationofpotatoexplants.试管薯和微型薯比较(Atlantic和Favorita）思考题1.归纳植物离体快速繁殖技术的主要步骤。2.采取哪些措施可防止或减轻外植体褐变及试管苗玻璃化？3.植物脱病毒方法有哪些，概述各种脱毒方法的原理。4.概述影响茎尖培养脱病毒效果的因素及脱病毒植株的鉴定方法。