流式细胞术检测T细胞亚群

流式细胞术检测T细胞亚群组长：杜建呈小组成员：李姚田呈（讲解）罗光珍范成芬钱洪珍目的1234了解流式细胞术的基本发展过程掌握流式细胞术的基本原理及应用掌握分选T细胞亚群的原理与方法掌握T细胞亚群分选的意义验实一1934年Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland–Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。二，流式细胞术的发展史1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，他在组织化学的基础上提出了两个新设想1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面的信息，用作鉴别细胞的依据。流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是VanDilla和美国的LosAlamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。三，流式细胞术的基本原理及应用一）流式细胞术（FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。1，其基本原理是将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管。2，在气体压力的作用下，悬浮在样品中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交相交点称为测量区。3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被呈900角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/数转换输入计算机。4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和生化指标。二）三）流式细胞仪的工作原理参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。数据处理原理：FCM的数据显示方式包括单参数直方图（histogram)，二维点图（dotplot），二维高等图（contour），假三维图（pseudo3D）和列表模式（listmode）等。四，T细胞亚群的检测1，实验内容：流式细胞术检测CD4+，CD8+T细胞。2，实验原理（1）：T淋巴细胞具有高度的异质性，根据其表面的标志和功能特征，可分为若干个亚群，各亚群之间相互调节，共同发挥其免疫学功能。因此，对淋巴细胞亚群数量的检测能反映机体的免疫功能状态。本次实验用流式细胞术检测CD4+,CD8+T细胞。（流式细胞术原理见前面流式细胞术的基本原理及应用）实验原理（2）T淋巴细胞表面的CD分子与相应荧光素直接标记的抗人CD分子McAb结合后，细胞表面形成带有荧光色素的抗原抗体复合物。经激光激发后发出与荧光素相对应的特定波长的荧光，其荧光强度与被测CD分子表达密度成正比例关系，由此通过流式细胞仪课检测结合含有相应荧光素标记抗体的阳性细胞百分率。3实验材料：（1）,肝素抗凝人全血（2）,荧光标记单克隆抗体：抗人CD4-FITC,抗人CD8-PE(美国BD公司产品）（3）,细胞洗液（含1%FCS的PBS)（4）,红细胞裂解液（5）,细胞固定液（25%戊二醛3.2ml，葡萄糖2.0g加无血清细胞洗液至100ml）。..（6）,FACS缓冲液1×PBS950MLFCS40ml10%叠氮钠溶液10ml.（7）,仪器缓冲液（FACS-flow),FACS清洁液（FACSclean)和FACS洗净液（FACSrinse)由仪器厂家提供。（8）,流式细胞仪。（9）离心机，吸管，试管等。4，实验步骤①混匀抗凝全血，加100ul全血于试管中，分别加入抗人CD4-FITC,CD8-PE单克隆荧光抗体各10ul，用振荡器混匀，避光放置15~30min（室温200C~250C)②加入溶血素2ml溶解红细胞，与振荡器上混匀，室温避光放置10min，1000rpm离心10min，弃上清液。③加入PBS缓冲液（有0.1%的NaN3）1ml洗细胞，1000rpm离心10min，倾去上清液，加入固定液300ul重悬细胞，BD-FACBCalibur流式细胞仪检测。④细胞的吸入，将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处，先预检测样品，然后进行实际检测。课根据细胞的浓度选择测定的速度（低，中或高）。所有的数据将自动存入微机。5使用后的清洗①将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1min②将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1min③再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5min④同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5min⑤最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔，关闭机器。⑥将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。6，FCM分析7，结果判断：如上图所示，CD3+T细胞占细胞总数的66.82%，其中CD4+T细胞占51.59%，CD8+T细胞占14.83%。8，注意事项：确保细胞悬液上机检测前浓度为1×105/ml,细胞浓度过低直接影响检测结果。使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合实际位点，常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的1g对照。注意染色后避光，保障细胞免疫荧光的稳定。样品制备好后如果不能立即上机检测，须置于40C冰箱避光保存9，问题与思考①FCM的基本原理是什么？②如何使用FCM技术来检测一肿瘤患者的PBMC中的T细胞组成变化？③在操作FACS时，有哪些注意事项？④FCM在免疫学中，有哪些具体的运用？请举三例说明⑤细胞亚群的检测有何意义？请举例说明Thankyou