泌尿系统与男性生殖系统药效学研究设计方法

泌尿系统与男性生殖系统药效学研究的设计和方法第一节急性肾功能衰竭药一、试验设计的医学基础急性肾功能衰竭(简称ARF)是危急重症，属中医“癃闭”、“关格”、“肾风”等范畴。其临床表现主要是小便点滴而下，或点滴全无，起病往往突然发作。治疗乃根据“腑以通为用”的原则，着重于通。实证宜清湿热、散瘀结、利气机而通水道；虚证宜补脾肾、助气化而达到小便自通的目的。改善少尿、氟质血症和肾小管坏死是治疗ARF药效学的主要研究内容。二、药效学研究的实验设计(一)急性肾衰动物模型l常用动物模型(1)大鼠血红蛋白尿ARF模型；以甘油肌内注，24h后即有尿素氮升高，少尿或无尿等类似人的ARF症状。(2)犬去甲肾上腺素模型：雄性犬麻醉以适当的去甲肾上腺素经—侧肾动脉连续滴注，引起肾流量急剧下降，同侧输尿管收集的尿量也相减少等一系列肾衰症状。(3)犬夹闭肾动脉引起的ARF模型：麻醉犬用外科手术暴露肾动脉夹闭1h，引起的缺血性肾功能衰竭。(4)汞剂引起的动物ARF模型：以适当剂量的氯化汞静脉注射家兔，皮下或静脉给大鼠，l—2日引起肾小管损伤，出现急性肾功能障碍的—系列变化。(5)大鼠抗生素ARF模型：大剂量抗生素(庆大霉素)给大鼠腹腔注射，通过影响肾小管上皮细胞膜脂代谢及抑制线粒休的能量代谢，造成肾小管损害，引起尿量改变及尿蛋白和尿素氮升高等急性症状。2观察指标(1)生化指标：①血肌酐(BUN)、血清尿素氮(Scr)水平；②24h肌酐、尿素总排出量；③24h肌酐清除率。(2)尿常规检查：①24h总尿量；②24h蛋白和管型等。(3)病理形态学检查。(4)其他可供分析的指标：①血清总蛋白和白蛋白；②对主要以损害肾小管功能的模型；如庆大霉素ARF模型可选择NAG酶及溶菌酶作为观察指标反映肾小管损伤的严重程度。3，方法学评价(1)ARF模型较多，从机制分为缺血性和中毒性。一般认为大鼠血红蛋白尿性ARF模型二种机制均有，接近于人的创伤性ARF，特别是积压综合征。在此模型早期，肾血管阻力增加，肾血流量减少，肾皮质区域的血管重度收缩，如所试药物可能有类似于异博定的降低肾血管力、增加肾血流量等作用，采用此模型较适当。本模型所用动物价廉易得，方法简便，病变稳定，在—定时间内做动态观察，也可用家兔，以便多次采血检查。此模型是新药药效较常用的模型。(2)家犬去甲肾上腺素及家犬夹闭动脉引起的ARF模型均属缺血性ARF，机制相同，所用动物相同。(3)汞剂引起的ARF属于中毒性ARF模型。特点为简单易行，病变较稳定，用家兔、大鼠、小鼠作模型动物。(二)相关药效学试验和机制研究1，辅助试验对能反映解除主症有作用的其他试验，如药物的利尿作用、血管扩张作用对高血钾，酸中毒的控制作用，以及药物对其他原因引起的氮质肌症的影响，均可酌情选用。2．作用原理研究如用水清除率、截流分析实验、肾小管微穿刺技术等探时药物作用部位和功能。这研究对了解新药特点很有意义。(三)阳性对照药(1)地塞米松。(2)维拉帕米(异博定)。三、急性肾衰动物模型建立方法(一)大鼠血红蛋白尿ARF模型1．原理肌内注射甘油后，大鼠肾血流减少，肾小管内皮细胞肿胀，增大了肾血管阻力，血管节段性坏死，外膜纤维化．血管自身调节功能丧失，导致肾小球滤过下降。另外，肾小球及肾小管用围纤维蛋白沉积，血臂内血液淤积，血栓形成，血流不畅，导致肾小球滤过率下降，肾小管坏死。2．操作方法采用体重150～250g雄性大鼠，置代谢笼中。纪录正常饮水量从尿量，用药前禁水24h。选体重减轻并有脱水的大鼠以50％甘油按10ml／kg分别在两侧后肢肌内注射.大鼠自由进食和饮水，—般于2h后出现血红蛋白尿，48h形成稳定模型。1—5日内进行实验。3．造模成功指标和药物疗效观察(1)24h尿量较对照组明显减少，尿蛋白明显升高。(2)BUN、Set明显增高，血清总蛋白减少。(3)血清K、Na增高。(4)病理学检杳可见明显的肾小管病变。所试药物的药效可根据用药后对以上指标的改善来评价，结果进行组间比较，统计学处理采用t检验。4．注意点(1)个别大鼠叫在肌注甘油后，肾脏损害过重而北亡。(2)禁水24h后体重减轻明显，脱水严重的大鼠选作实验动物效果较好。(二)犬去甲肾上腺素ARF模型l原理去甲肾上腺素引起肾血管收缩而致肾小球的血流减少，肾小球滤过减少；组织缺血、缺氧加重对肾组织损害从而产生ARF。2．操作方法取10—20kg雄性家犬，以戊巴比妥钠30mg／kg，静脉注射麻醉后，于术分离—侧输尿管，插入管收集尿液。从肾动脉按每分钟0．75ug／kg，滴注去甲肾上腺素，连续40min停药。1—4h内可进行实验。对照组用地塞米松或右旋糖酐(静脉注射)。肾衰阴性对照组用等量生理盐水，每组动物至少5只。3．药物疗效的评价指标(1)尿量及尿常规检查(用药前1h及用药1h、2h、4h后)。(2)BUN、Scr、血清总蛋白和白蛋白、血清K和Na(药前1h及用药1h、2h、4h后)。(3)病理学检查。所试药物的药效可根据以上指标的改善来坪价，结果进行检验作组间比较。4．注意点(1)集尿套管内应预充满温水并防止导臂弯曲而阻碍尿液通畅。(2)实验前勿给高蛋白饮食(如肉类)，否则影响BUN水平。(三)犬夹闭肾动脉引起的ARF模型1．操作方法取10-20kg雄性家犬，以戊巴比妥钠30ug／kg静脉汴射麻醉，于术暴露左侧肾动脉，夹闭1h后放开，使血流再通，从侧输尿骨导管收集尿液。肾衰阳性对照组用地塞米松(0．1mg／kg)或右旋糖酐(相对分子质量75000，10ml／kg，静脉注射)。肾衰阴性对照组(只手术，不夹闭肾动脉)用等量生理盐水，每组动物至少5只。2．原理、评价指标等同犬去甲肾上腺素模型。(四)汞剂引起的动物ARF模型1．原理一般认为是由于汞离子经肾小球滤过后，被肾小管上皮细胞重吸收，并在细胞内累积．与细胞膜和细胞内巯基(一SH)和二硫基(一S一S一)等结合，影响酶活性。受累细胞由于汞—硫反应而损害细胞及其膜的功能与结构，细胞呼吸功能丧失，变性坏死，并部分脱落于管腔中阻塞肾小管，使原尿通过受阻。受损的肾小管通透性增高，原尿漏出并返回肾血管，因而产生少尿、无尿。原尿漏至肾间质，形成间质水肿，压迫肾小管。氯化汞中毒还可引起肾血流重新分布，肾皮质缺血，髓质淤血，肾小管滤过减少，也是引起ARF的原因之—。2．操作方法2kg以上的健康成年家兔，雌雄均可。以氯化汞2．5mg／kg—次静脉注射(氯化汞可用生理盐水或蒸馏水配成适当浓度的溶液)。测定前3日的血，尿的尿素氮和肌酐含量，取平均值作自身对照；注射氯化汞后的的5日，每天作同样测定，以后可改为隔天或多日测1次，至肾功能正常。进行尿常规检查。3．注意点(1)HgCl2溶液必须是新鲜配制。(2)精确收集24h尿(在收集甜内事先加入少量甲苯，以防腐败)。(3)实验动物所食饲料、青菜不加限制。(五)庆大霉素ARF模型1．原理大剂量氨糖类杭生索(AG)在动物体内大部分以原形从尿中排出，小部分被近端小管吸收，导致药物在肾皮质蓄积。抑制肾皮质细胞溶酶体内的磷脂酶A和C，导致磷脂、磷脂酰肌醉在溶酶体内菖积，溶酶体由于磷脂的沉积，最后破裂而致细胞损伤。此外，AG还作用于线粒体氧化磷酸化，造成肾小管损伤。2．操作方法Wistar雄性大鼠，体重250—300g，腹腔注射庆大霉素140mg／kg(体重)，共7日，治疗组动物注射的同时给药物；阳性药用维拉帕米，每大鼠每日灌胃15mg／kg(体重)；空白对照则给溶剂。3．评价指标(1)尿量及尿常规检查。(2)BUN、Scr，血清总白和白蛋白，血清K和Na。(3)尿NAG酶反溶曲酶的检查。(4)病理组织学检查。第二节慢性肾功能衰竭药一、实验设计的医学基础慢性肾功能衰竭(简称CRF)由于多种慢性肾患发展到晚期，肾实质损害引起肾功能严重损害，体内氮质及其代谢产物潴留，不能维持体内水、电解质及酸碱平衡而引起临床症状，是一危重综合征，祖国医学虽无CRF这个病名，但根据其发病，症状及演变规律，可归纳为“关格”、“癃闭”、“溺毒”、“虚劳”等。患者多见倦怠乏力、气短懒言、纳差腹胀、恶心呕吐、四肢麻木、皮肤瘙痒、腰腿酸软、面色晦暗、肌肤甲错、舌淡有齿痕或色紫暗并有瘀斑、舌苔白滑或厚腻、脉沉弱。综上所述属脾肾气虚证并兼有湿浊或瘀血，故以“健脾益肾，通腑降浊、活血化瘀”法治疗。现代医学则以改善肾功能，促进氮质化合物等毒素的排出，纠正水、电解质和酸碱紊乱，纠正贫血等方法以延缓病程进展。二、药效学研究的实验设计(一)对疾病动物模型的治疗作用试验1．常用动物模型(1)大鼠腺嘌呤CRF模型：大鼠经含0．5％～0.75％腺嘌吟(adenine)饲料喂养引起的。(2)大鼠5／6肾切除的CRF模型：经两期外科手术切除大鼠5／6肾造成的CRF。(3)大鼠经液氮冷冻肾脏引起的模型：和模型(2)相似，只是用冷冻代替一期手术的大部分切除。(4)小鼠电凝摘除肾脏CRF模型：以电烧灼小鼠右侧肾表面，2星期后摘除左肾的外科手术制作的模型。(5)其他模型，如柔红霉素、阿霉素等致大鼠CRF模型。根据新药可能的作用机制特点选择适当的模型。以上模型的具体建立方法将在后面叙述，试验治疗的给药途径应与临床一致。2观察指标(1)各组动物血液毒素物质的比较:一般认为尿毒症毒素物质应具备以下几个条件：①该物质的理化性质和结构明确；②血液中的浓度增高；③该物质与CRF特定的临床发现相关；④随血液中该物质浓度降低，临床症状和体症改善；⑤在肾功正常的实验动物中能用该物质复制与CRF类似的临床症状。目前已从CRF患者中分离出约200种蛋白质代谢产物，其中100多种物质成分比止常值高，这些毒素物质分为小分子(相对分子质量小于500)，如肌酐、尿素氮、胍类和胺类；中分子(相对分子质量为500—5000)；大分子(相对分子质量大5000)，如旁腺索、生长激素等。凡是公认为CRF毒素物质应当是反应新药疗效最主要的指标，目前临床和评价药效多用的观察指标是肌酐、尿素氮。(2)其他可供分析的指标：①各组动物间体重、死亡率的比较；②尿量及尿液成分分析(主要为尿蛋白含量的比较)；③各组动物红细胞数、血红蛋白和红细胞比积的比较；④各组动物间血钠、钙、磷、钾等电解质含量的比较；⑤肾脏组织病理学观察。(二)相关药效学试验1．血压试验按常规方法观察药物对大鼠血压的影响。2．利尿试验用水负荷大鼠或CRF模型大鼠常规方法观察药物有无利尿作用。(三)阳性对照药1．包醛氧淀粉或爱西特(活性炭)适用于以吸附肠道毒素来促进毒裹排除、缓解症状的新药。2，尿毒清颗粒刑适用降低毒素、改善肾功能为主要功效，用于慢性肾功能衰竭、氮质血症和尿毒症早期的新药。3．地塞米松地塞米松0．1mg／kg(体重)肌内注射，每日一次，属非特异性作用，可减轻病情。三、动物模型建立方法(一)大鼠腺嘌呤CRF模型1.原理高浓度腺嘌吟通过黄嘌呤氧化酶的作用生成极难溶于水的2，8—二羟腺嘌吟，后者沉积在肾小管，影响了氮质化合物的排世，导致氮质血症、毒素蓄积从电解质和氨基酸代谢紊乱，最终引起肾功能衰竭。2．制作方法用含0．75％腺嘌吟(adenine)饲料喂养大鼠，每日投放量约350mg／kg(体重)。全部动物自由摄取饲料和饮水。3．造模成功的指标和药物疗效观察大鼠随着进食腺嘌吟饲料的日数增加而日渐消瘦，畏寒拱背，体毛脱落，生长抑制．多尿；血肌酐、尿素氮水平升高(喂饲2星期后可见升高)；中分子物质水平升高；电解质代谢紊乱(高磷、高钾、低钠、低钙等)；氨基酸紊乱(主要为必需氨基酸降低)；贫血。病理学观察表明，肾脏明显增大(第八星期较肾脏大4倍多)，肾组织内有大量腺嘌崎代谢物结晶沉积，大部分肾小管破坏，有淋巴细胞浸润，局部纤维纵织增生。药物疗效观察：(1)一般观察：动物的体重、尿量、体毛和—般活动状况。(2)生化及血液检查。(3)尿液检查：24h尿量及尿蛋白总量。(4)肾脏病理形态学观察：肉眼及组织学观察，有条件时可作病理切片的图像分析。4．注意点(1)为了减少差异，最好用雄性动物。(2)采血时应特别住意防溶血.(3)配制饲料时，腺嘌呤要充分与饲料混合均匀。(4)亦可