化学发光与电致化学发光

化学发光与电致化学发光Chemiluminescence(CL)&ElectrogeneratedChemiluminescence(ECL)崔华中国科技大学化学系化学发光实验室化学发光一、化学发光现象萤火虫发光生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是，直到十九世纪末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。1877年洛粉碱CL1905年洛粉碱类似物1928年鲁米诺1935年光泽精1960sPMT出现发现许多有机反应可产生CL所谓化学发光(CL),就是化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态激发到激发态从而产生发光的现象。化学发光反应能级图直接化学发光A+BC*+DC*C+h例:NO+O3NO2*+O2NO2*NO2+h二、化学发光反应的分类•间接化学反应发光A+B—C*+DC*+E—E*+CE*—E+h例:ArOCOCOOAr+H2O2OCCOOO+2ArOHOCCOOO+FOCCOOO-.F+.OCCOOO-.F+.F*+2CO2F*F+hv三、化学发光反应发生的条件化学反应是放热反应。化学反应的自由能的变化与发光波长的关系:–Ghc/ex2.857×10–4千卡/ex摩尔400~750nm的可见光发射时所需要的G的数值应在38~71千卡之间。必须存在形成电子激发态的通道。激发态分子必须以辐射光子的形式回到基态,或将能量传递给荧光分子。四、化学发光反应的机理激发态氧生成型H2O2+Cl22HCl+O2*O2*O2+h低浓度单分子发射1268nm高浓度双分子发射634nm分子对同时跃迁双氧基化合物分解最有效的化学发光反应与双氧基化合物的分解有关。NH2ONONH2O2OH-NH2NNO-O-NH2COO-COO-*OO基态＋h电子转移反应e-中性分子自由基阴离子氧化剂++受激分子还原了的氧化剂自由基阴离子与氧化剂之间的电子转移自由基阳离子与还原剂之间的电子转移NNRu33+NNRu32+N2H4H+H2Oh五、化学发光反应无机物的化学发光一些无机物能够产生很弱的化学发光，例如：硫酸氢盐被铬酸氧化水被K、Na、Mg汞齐分解Al被空气中氧氧化强酸被强碱中和亚硫酸钠被空气氧化有机物的化学发光烃醇、醛、酮、酸、酯多酚杂环化合物典型的化学发光反应鲁米诺(luminol)3-APAmax=425nm氧化剂:H2O2O2KMnO4NaClOI2[Fe(CN)6]3-.催化剂:过氧化酶氧化血红素过渡金属离子(Co2+、Cu2+、Fe3+)抑制剂OXIDANTBASEluminol*3-Aminophthalate+h光泽精(lucigenin)NCH3NCH3++.2NO3-OxidationOH-NOCH3*NMA+LIGHTLucigeninN-METHYLACRIDONE(NMA)max=440nm(绿色)氧化剂:H2O2还原剂+O2还原剂:乳酸尿酸抗坏血酸催化剂:过渡金属离子抑制剂:酚类物质对此反应有抑制作用过氧化草酸酯(peroxyoxalates)ArOCOCOOAr+H2O2OCCOOO+2ArOHOCCOOO+FOCCOOO-.F+.OCCOOO-.F+.F*+2CO2F*F+hv氧化剂:H2O2此反应本身能产生弱的化学发光max=440nm,550nm.邻菲罗林(1,10-phenanthroline)NNCHONNCHO+H2O2+hv氧化剂:H2O2催化剂:Cu2+Co2+Pb2+Fe3+Ni2+抑制剂:蛋白质与Cu2+形成络合物ThemolecularstructureoftheusedacridiniumesterNHSMechanismofAcridiniumSaltChemiluminescencewithhydrogenperoxideOrg.Lett.(2003)21:3779–3782吖啶酯•Alkalinephosphatase(ALP)dephosphorylatesAMPPD(1,2-二氧杂环丁烷类）toformadioxetaneanion,whichfragmentsintoadamantanone（金刚烷酮）andtheexcitedstateofmethylmeta-oxybenzoateanion（间氧苯甲酸甲酯阴离子）,thelightemitter.•ThedetectlimitofALPis10-21mol/L.•ThederivativesofAMPPDaresuperiorthantheparentcompoundtothelightingratesandsignalintensities.1,2-二氧杂环丁烷类萤火虫发光(fireflyBL)Luciferin+ATP+O2luciferaseAMP+Oxyluciferin+hvmax=562nm此反应重要的分析对象是ATP10-11~10-14mol细菌发光(bacterialBL)FMNH2+O2+RCHOluciferaseFMN+RCOOH+H2O+hv还原型吡啶核苷酸黄素主要分析物FMN10-12mol此反应常用于NADH和NADPH试验10-15molmax=490nmFMN+NADHNADH脱氢酶FMNH2+NAD六、化学发光的表征动力学曲线（反应时间）光谱量子产率化学发光强度七、化学发光分析R+AB+h—dcAdtk[R][A]使[R]过量kCA(t)CA(t)=CA0e-ktIcL(t)=cl=clkCA(t)=clkCA0e-kt尽管A物质的CA0各不相同,但I达到Imax的时间相同.e-k’t为常数.Icl(t)CA0定量分析的依据利用发光反应动力学曲线对催化物质的分析MICCIMMCkIemlgMeCMktIMAkRMARkdtdChBARAAACLtMktMAACLCLAMmax00max0max01/1)(不变不变＝过量八、化学发光的探测•分立式进样化学发光仪PMTR1R2s这类仪器适合于选择性好,量子效率高或发光体寿命长的化学发光反应的监测。不适用于快速化学发光反应(15S)的重现性监测。•流动注射进样化学发光仪样品samplewastePMTrecorder蠕动泵流通池(flowcell)九、化学发光分析的特点•优点:灵敏度高,线形范围宽；仪器简单,价格便宜；分析时间短。•缺点:选择性差。电致化学发光一、电致化学发光现象电致化学发光(ECL)是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。二、典型的电致化学发光反应.多环芳烃的ECL按激发态分子或离子产生的历程可分为两类:通过单重激发态途径的ECL(S-routeECL)R-e→R.+电极氧化R+e→R.-电极还原R.++R.-→R+1R*自由基湮灭1R*→R+hν发光过程9,10-二苯基蒽,将200Hz左右的方波电位(1.3-2.2Vvs.SCE)加到电极DPA-e→DPA.+1.3VDPA+e→DPA.--2.2VDPA.++DPA.-→1DPA*+DPA1DPA*→DPA+hν(λ=512nm)通过三重态途径的ECL(T-routeECL)R-e→R.+电极氧化R+e→R.-电极还原R.++R.-→3R*+R自由基湮灭3R*+3R*→1R*+R激发态转化1R*→R+hν发光过程N,N,N’,N’-四甲基苯二胺(简称TMPD)和DPA的混合溶液中,TMPD–e→TMPD.+0.16VDPA+e→DPA.--2.1VDPA.-+TMPD.+→3DPA*+TMPD3DPA*+3DPA*→1DPA*+DPA1DPA*→DPA+hν•鲁米诺的ECLonarotatingring(Au)-discelectrode(Au)systemdisc:OOHnegativepulsering:OOHO2positivepulseLHL鲁米诺的典型ECL反应机理•Ru(bpy)32+的ECLRu(bpy)32++e→Ru(bpy)3+电极还原Ru(bpy)32+-e→Ru(bpy)33+电极氧化Ru(bpy)3++Ru(bpy)33+→Ru(bpy)32++Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+*→Ru(bpy)32++h(λ=620nm)当体系中含有强氧化或还原性物质,只要施加单向正或负电压就可以得到Ru(bpy)32+的ECL。如典型的Ru(bpy)32+-C2O42-和Ru(bpy)32+-S2O82-体系：Ru(bpy)32+-C2O42-共存体系的ECL机理Ru(bpy)32+-S2O82-体系的发光反应机理:Ru(bpy)32++e→Ru(bpy)3+S2O82-+e→SO42-+SO4.-SO4.-+Ru(bpy)3+→Ru(bpy)32+*+SO42-SO4.-+Ru(bpy)32+→Ru(bpy)33++SO42-Ru(bpy)3++Ru(bpy)33+→Ru(bpy)32++Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+*→Ru(bpy)32++hPossibleECLmechanismofAEinalkalineaqueousinthepresenceofTPAAnal.Bioanal.Chem.(2011)399:3451–3458•吖啶酯的ECL三、电致化学发光仪PRECL仪器结构图自制的电化学发光池和组合电极示意图四、电致化学发光的特点灵敏度高,线性范围宽,仪器简单。化学发光反应的电化学诱发可对这些反应在时间上进行控制。可通过变换电位控制反应,改善选择性。光产生于电极附近,改善了分析探测的空间控制。不稳定试剂可现场产生。没有电化学探测中的电子干扰问题。一些化合物可在ECL反应中被循环使用。电极表面的污染问题。ECL体系较少,分析物种有限。机理问题。Thankyou!