流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究

1流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究祝洪奎中山大学化学与化学工程学院广州510275E-mail:[e-mail]摘要在酸性条件下，盐酸环丙沙星对Ce4+-Na2SO3微弱化学发光体系具有很强的增敏作用，据此建立了流动注射-化学发光分析盐酸环丙沙星的方法。由体系的动力学过程设计了最佳流路，并对Ce4+和Na2SO3浓度进行了优化。实验表明，环丙沙星的质量浓度分别在0.10-2.00mg/L和2.00-15.00mg/L之间时，相对发光强度与浓度有一定的线性关系，检出限为0.02mg/L，RSD（n=11,C=1.00mg/L）为6%。对盐酸环丙沙星药片的测量结果为1.48±0.09mg/L，方法的回收率在86%~117%之间。关键词化学发光盐酸环丙沙星流动注射环丙沙星(CF)的化学名为1-环丙-6氟-1,4-二氢-7[1-哌嗪基]-3-喹啉羧酸，是第三代喹诺酮类药物，抗菌能力强，对需氧革兰阴性杆菌及绝大多数菌株有较好的抗菌活性[1]，在临床上应用非常广泛。目前测定盐酸环丙沙星的分析方法主要有高效液相色谱法[2]、毛细管电泳法[3]、分光光度法[4]、电位法[5]、极谱法[6]等。但这些方法存在仪器昂贵或费时较长，以及操作复杂等问题。化学发光(Chemiluminescence，简称CL)分析法是分子发光光谱分析法中的一类，是指物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，所发出的光辐射。根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定组分含量的分析方法叫化学发光分析法。方法具有高灵敏度和宽的动态范围(3~6个数量级)、仪器简便和不存在空白等优点。由于不需要外来光源，从而减少或消除瑞利散射和拉曼散射，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪音的影响，大大提高了信噪比。作为一种有效的痕量分析方法，近些年在材料科学、环境科学和生命科学等领域中具有广泛的应用[7]。流动注射分析法（FlowInjiectionAnalysis,简称FIA）是一种溶液处理与进样技术，将流体的混合、分离等在密闭的管道内自动迅速完成后进行检测。与传统手工操作相比，具有以下特点：①广泛的适应性：可与多种检测手段联用；②高效率：100-300样/h，复杂的分析过程也能达到40-60样/h;③低消耗：10-100L/测定；④高精度：0.5%-1%的RSD，复杂的在线处理的测定精度可达1.5%-3%；⑤设备简单、价廉。将流动注射技术与化学发光分析相结合而产生的流动注射-化学发光分析法（FI-CLA），同时兼具操作简便、快速灵敏的特点，在生物、医学、药学、环境科学、仪器等诸多领域中受到广泛的应用[8]。研究表明：在酸性条件下，盐酸环丙沙星对Ce4+-Na2SO3化学发光体系具有强的增敏作用[9]。据此，本实验采用流动注射-化学发光分析法设计了Ce4+-Na2SO3化学发光体系测定盐酸环丙沙星的分析方法，对方法的测量条件进行了优化，并评估了方法的精密度与准确度，最后以加标回收的方法对药片中的盐酸环丙沙星含量进行了测定。1实验部分1.1仪器与试剂BPCL微弱发光测量仪（中国科学院生物物理研究所）；HL-2D恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；十六通阀（杭州）；联机计算机。硫酸铈溶液：4.010-4mol/L（实验室提供）；亚硫酸钠溶液：8.010-2mol/l（实验室提供）；盐酸环丙沙星标准溶液：100.0mg/L（实验室提供）；盐酸环丙沙星药片处理液（实验室提供）。所用试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。1.2操作方法根据静态法测得的反应动力学曲线（图1），设计图2所示流路，设置泵速为60r/min负高压为-850V，温度缺省，在基线稳定后以图2所示流路将Na2SO3溶液与盐酸环丙沙星溶液混合后，再注人作为载流的酸性硫酸柿钱溶液中，用光电倍增管检测所产生的化学发光并记录相对发光强度。2结果与分析2.1动力学曲线与流路设计采用分立取样式，研究该体系的化学发光反应动力学曲线，即记录在反应物部分混合后，发光强度随时间的变化曲线。采用将反应物分为底液和加入液两部分，一混合即开始检测，具体加液方式见表1，最终的动力学曲线见图1。已知在酸性条件下，CF对Ce4+-Na2SO3化学发光体系具有强的增敏作用。由动力学曲线可知，反应并未一开始就进行，可能是体系为多级反应(可能为Ce4+-Na2SO3体系的多级，也可能为CF增敏作用过程引起)，但本反应体系是一个快速反应（峰形宽度仅为2s多），因此CF必须在Na2SO3与Ce(Ⅳ)氧化还原前就加入体系，否则如表1的1号将可能得不到信号。而2号的加入方法使Ce(Ⅳ)相对浓度较低，即反应量小，发光物质少，而CF量过高，又可能会有吸收辐射作用，使峰强度较小。3号加入方法的Ce(Ⅳ)对CF的活性可能有抑制作用，当然这两者都会吸收光辐射。因此最优方案为4号加入法。按上述结果所设计流路如图1所示，先将Na2SO3溶液和CF溶液充分混合后用十六通阀注入Ce(Ⅳ)载流液中，在弯曲盘管中进行反应并及时检测。序号底液（a.q.）mL加入液(a.q.)25μL峰相对强度221Na2SO3Ce(Ⅳ)CF02Na2SO3CFCe(Ⅳ)703Ce(Ⅳ)CFNa2SO35404Ce(Ⅳ)waterCF+Na2SO31244表1静态法测反应的动力学P.蠕动泵;V.十六通阀;F.流通池;W.废液;PMT.光电倍增管;AMP.放大器;HV.负高压;PC.联机电脑；a.环丙沙星溶液;b.亚硫酸钠溶液;c.硫酸铈溶液.2.2硫酸铈浓度的影响固定Na2SO3浓度为810-4mol/L，流速60rpm，分别在空白和环丙沙星10mg/L的条件下考察Ce4+溶液浓度在110-5510-3mol/L范围内变化对体系信号的影响，见图3（已扣除对应空白，由于横纵坐标是数量级的变化范围，取对数以使点较均匀分布）。实验表明，当Ce4+浓度太低时，由于反应量太少，生成发光物质量减少，化学发光信号较弱；当浓度过高时，铈离子溶液可吸收光辐射，也会导致化学发光信号降低。当Ce4+浓度为110-3mol/L，化学发光信号最大。但由于本实验时长有限，实验进行时未来得及扣除空白，因此当时取了5.010-4mol/L做为最大发光强度条件。图1反应的动力学曲线图2流动注射-化学发光系统示意图2.3亚硫酸钠浓度的影响固定Ce4+浓度为5.010-4mol/L（已优化得到的），流速60rpm，分别在空白和10mg/L的条件下考察Na2SO3在1.010-41.010-1mol/L范围内变化时对信号值的影响，见图4（峰由于横纵坐标是数量级的变化范围，取对数以使点较均匀分布）。实验表明，当Na2SO3浓度太低时，由于反应量太少，生成发光物质量减少，会使得化学发光信号减弱；当浓度过高时，Na2SO3溶液可吸收光辐射，也会导致化学发光信号降低。当Na2SO3浓度为1.010-3mol/L，化学发光信号最大。图4亚硫酸钠浓度对发光信号的影响图3Ce4+浓度对发光信号的影响2.4工作曲线、检出限和精密度在选定的最佳条件下，测量相对发光强度与盐酸环丙沙星浓度在0.10mg/L~15.00mg/L范围的关系，结果表明在高浓度区线性与低浓度区的线性斜率有较大差距，因此将线性范围分为高、低两个浓度区间。在CF标准溶液为0.10-2.00mg/L时，得到直线方程为I=1429c-52.05，相关系数的平方R2=为0.9927；在CF标准溶液为2.00-15.00mg/L时，得到直线方程为I=435.8c-2497，相关系数的平方R2=为0.9742。对1.00mg/L盐酸环丙沙星标准溶液平行测定11次，得相对标准偏差RSD为6%，根据IUPAC建议，计算出方法的检出限为0.02mg/L。范围mg/L方程R2检出限mg/LRSD(n=11,c=1.00mg/L)%0.10-2.00I=1429c-52.050.99270.0262.00-15.00I=435.8c+24970.97422.5实际样品分析取处理好的盐酸环丙沙星药片处理液，在已优化好的条件下，采用该实验方法测定其含量，同时进行标准加入回收实验，准确加入0.75、1.25、1.75mL的100mg/L的标准溶液，用样品溶液稀释到25.00mL后进行测定。实验表明处理液的环丙沙星质量浓度为1.48±0.09mg/L，加标回收率在86%~117%之间。由结果可知，测量方法的RSD较大，而加标回收率也超出了95%~105%的范围，总之，方法的精密度与准确度都不够理想，且重现性（或稳定性）较差，这由图3、图4、平行11次测量和最后加标回收时的平行测量RSD处于较大的变动范围可得。分析如下：a)除去溶液配制及量具等可能引入的不确定度外，本实验最大的影响可能源自进样操作。由于十六通阀上的样品液进样阀由手工操作，阀的来回过程不具有好的稳定与重复性，阀间的渗液会影响下一次或下几次的测量。解决的方案可考虑用自动化操作来代替手工操作，最好直接与电脑软件联用集成，通过软件进行控制，可大大提高可重复性；b)另一个重要的误差来源是溶液的不稳定性，实验中发现放置一段时间后测得浓度与之前会有一定表2工作曲线、检出限与精密度图5CF测定工作曲线（0.10-2.00mg/L）图6CF测定工作曲线（2.00-15.00mg/L）6的差别，特别是对于亚硫酸钠溶液（易被氧化），因此实验所用各溶液应尽量新配制，且测量过程不宜中断太长时间；c)由于实验溶液的浓度都非常小，因此交叉污染的影响特别大，溶液配制与使用中各器具应充分清洗；加标回收时由于是加入少量的高浓度溶液，对体积的准确性要求较高，实验中可能未达到相应要求以致回收率偏离过大。样品加标量mg相对发光强度CF浓度mg/LCF质量g回收率%RSD(n=3)%处理液0.00021741.480.037--1.8加标10.07542674.060.101860.4加标20.12556887.320.1831173.5加标30.17566469.520.2381153.42.6问题与思考2.5.1化学发光和其它分子发光（荧光、磷光）的有什么异同点原理上：同属于发射光谱中的分子发光，都是由于分子的外层电子在辐射能的照射下，吸收能量跃迁到激发态，在返回基态的过程中产生了光辐射（一般都为紫外或可见光）。但化学发光的激发能来自化学反应（反应焓），而荧光（磷光）来自于光辐射能。仪器上：荧光分析仪一般包括光源、单色器、样品池（与光源成垂直）、检测器和记录显示装置，而磷光比荧光多杜瓦瓶和斩光片。化学发光不需要光源和单色器，但一般会用到单独的进样装置和反应管。结果上：荧光分析结果一般有由波长与光强对应的激发光谱图和发射光谱图，可提供大量的信息以供分析，可同时进行定性和定量分析，选择性好。而化学发光仅得到相对发光强度随时间变化的图形，是对整体的表征，难以区分具体物质。应用上：由于化学发光物质较少，且发光机理不够清楚，因此化学发光的应用范围相对较小，但在化学反应机理的研究上有重要地位。2.5.2为什么测量完一系列标准样品溶液后要走空白到基线值相近才可以测量药片中样品的浓度因为标准样品溶液是由稀到浓进行测量，因此测到后面的溶液浓度相对于待测样品可能很高，则管道中的残留量很可能对待测样品有很大影响，因此应该用空白冲至基线以保证测量结果的准确。2.5.3与其它测量盐酸环丙沙星的分析方法相比，本实验方法有何优缺点目前测定盐酸环丙沙星的分析方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法、电位法、极谱法等。这些方法存在仪器昂贵或费时较长，以及操作复杂等问题，而化学发光分析方法仪器简单、操作方便。但本方法无法区分测量对象，因此对溶液组成成分要求较高，即必须经前处理使溶液成分简单，且可反映出反应的动力学过程。同时方法的稳定性不够理想，尽管本实验已经采用了流动注射方法来提高精密度，但重现性依然不够理想。总之，本方法可满足一般性测试要求，但若作为仲裁分析等