4.植物化学2

天然产物化学中山大学生命科学学院广州现代中药质量研究开发中心王永刚分离方法概述分馏法色谱法Chromatography1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时首次采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。分离方法概述分离方法概述色谱法Chromatography在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液从不同角度，可将色谱法分类如下：1.按两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC）根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）.2.按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。3.按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。4.按照展开程序分类按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。适用性：是最常用的层析方法之一，适用于亲脂性成分分离。广泛应用于生物碱、甾体化合物、强心苷、精油、内酯化合物等中草药成分的分离。优点：价廉、分离效果好、再生容易、活性容易控制而能适应不同化合物层析要求等优点。缺点：有部分酚性化合物(如黄酮类化合物)、部分酸性物质(如部分三萜酸)，能与氧化铝结合因而不能应用，但有时也可先制备其衍生物，先保护能结合的基团后再进行层析；此外还有操作不便、手续繁、周期长、处理量有限等缺点，限制了它在工业生产上大规模应用。常用色谱分离法氧化铝层析1.碱性氧化铝碱性氧化铝应用于碳氢化合物的分离和从碳氢化合物中除去含氧化合物，以及某些对碱溶液比较稳定的中性色素、甾族化合物、生物碱、醇，以及其他中性、碱性物质的分离。2.中性氧化铝中性氧化铝使用最广泛，适用于醛、酮、醌、某些苷及酸碱溶液中不稳定的化介物如酯、内酯等化合物的分离。3.酸性氧化铝酸性氧化铝适用于天然及合成酸性色素及某些醛、酸的分离。氧化铝分类常用色谱分离法氧化铝层析氧化铝层析操作1.层析柱的选择其内径与柱长的比例，一般在1:10~20之间。2.氧化铝的装柱3.样品的加入4.层析洗脱及所用溶剂常用色谱分离法氧化铝层析实例：黄芪鉴别，《中华人民共和国药典》（2005年版第一部，P212）常用色谱分离法氧化铝层析常用色谱分离法硅胶层析色谱的基本流程图淋洗液泵色谱柱检测器泵液分离检测记录进样阀抑制器检测池进样分离方法概述色谱法分离方法概述色谱法min051015202530354045mAU0255075100125150175DAD1B,Sig=320,10Ref=400,100(HJH0206\025-1501.D)1.7612.0863.0704.1024.5505.8206.6517.94710.97212.96617.95820.43423.05124.24827.07729.24929.96733.36135.71737.14038.40845.54648.788分离方法概述色谱法分离方法概述色谱法平面色谱分离方法概述色谱法分离方法概述色谱法电泳技术较前述几中层析技术发展略迟。1937年Konig用滤纸进行了第一次电泳。由于电泳具有快速、准确、易重复的特点，并可用洗脱法和光密度法求出各组份的含量，已发展为层析的基本技术之一，广泛应用于生物化学、药物化学及临床诊断方面。在天然产物的成分分析中，电泳技术也应用于生物碱、有机酸、氨基酸、蛋白质、糖类的分离和鉴定工作中。0102030405060708090100-5100200300shuitiyemAUmin1-12.4172-15.1333-21.2924-26.8835-34.9756-41.3337-43.1008-45.8509-51.10010-53.13311-56.52512-57.44213-59.75814-68.35815-80.10016-90.517WVL:300nm0102030405060708090100-5100200300D101mAUmin1-45.6502-50.8673-52.8674-56.2755-57.1926-59.5177-68.1258-79.8679-90.333WVL:300nm乙醇浓度0%10%20%40%60%80%醇洗量(mL)3001005010050100501005010050HCl-Mg-----++++--黄酮量(mg)---------0.00.033.5318.929.15.670.00.0干浸膏(mg)629.173.519.5127.742.8298.650.139.013.015.27.27出膏率(%)7.860.920.241.600.543.730.630.310.160.190.09洗脱率(%)---------------31.7317.927.65.37------含量(%)---------------11.2337.874.843.6------0102030405060708090100110120-5125250450120%240%360%480%mAUmin4321WVL:300nm取药材，加12倍量水浸泡过夜，提取1小时，滤过，滤渣再提取2次，每次加12倍量水，每次提取1小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.10～1.15(70℃)，加乙醇使醇浓度达到70%，放置12小时，滤过，弃去滤渣，滤液回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.10～1.15(70℃)，放置5天，析出固体，滤过，将固体在60℃干燥，即得有效部位。生产工艺的研究药材提取1小时，滤过，滤渣再提取2次，每次加12倍量水，每次提取1小时，滤过滤渣滤液弃去浓缩液加乙醇醇沉滤渣弃去浓缩滤液回收乙醇并浓缩浓缩液放置，析出固体，滤过，干燥有效部位成品制粒，装胶囊，包装GelfiltrationchromatograhpyAffinitychromatograhpyElectrophoresisIon-exchangechromatography