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实时荧光定量PCR技术熊英2014年12月05日ABI荧光定量PCR仪ABI7000边缘效应罗氏的荧光定量PCR仪滤镜轮CCD相机多孔板物镜均一的激发和检测，无光程差采用折叠光路增加光程，降低激发高度罗氏LC480教学安排定量过程化学原理定量原理的数学依据定量要素应用实例提出问题如何检测某个致病/抗旱/肿瘤/某种功能基因在不同条件下的表达情况？针对mRNA的原位杂交；针对对应蛋白质的检测；实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR---不开盖测定核酸闭管化学（降低污染风险）；无后处理（无需跑胶照相等）；高度自动化；定性定量分析，SNP鉴定传统的终点PCR定量终点法的结果96个样品的重复性PCR扩增曲线Rn(荧光信号)循环数CycleNumber指数增长期平台期阈值和Ct值Rn(荧光信号)循环数CycleNumber阈值ThresholdCtSampleNoTemplateThresholdBaselineRn-Ct阈值和Ct值Rn+标准曲线Ct起始拷贝数或起始浓度教学安排定量过程定量原理的数学依据化学原理定量要素应用实例PCR理论方程Where:Rn=TotalfluorescencesignalRB=BasefluorescencesignalXO=InitialnumberoftargetmoleculesEX=Efficiencyoftargetamplificationn=NumberofcycleRS=FluorescencesignalpertargetmoleculeSnXOBnREXRR)1(当n=CT时，Rn=RT，即设定的阈值RT=RB+XO(1+Ex)CTRslog(RT-RB)=logXO+CTlog(1+Ex)+logRsCTlog(1+Ex)=log(RT-RB)-logXO-logRsCT=a·logXO+b)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXC教学安排定量过程定量原理的数学依据化学原理定量的要素应用实例化学原理TaqMan®探针SYBR®GreenISYBR®GreenI荧光原理变性延伸扩增完成SYBR®GreenI熔解曲线FRET荧光能量共振转移TaqMan®探针5’3’5’5’3’5’RQ正向引物TaqMan®探针反向引物5’3’5’5’3’5’QR正向引物反向引物其它类型的荧光标记分子信标LUX引物荧光分子比较以上是来自Invitrogen公司的比较。TaqManProbesMolecularBeaconsSYBRGreenILUXPrimers灵敏度**********动态范围**********特异性*********多重反应****N/A***熔解曲线分析N/AN/A******设计简单********费用********教学安排定量过程化学原理定量原理的数学依据定量的要素应用实例目标基因未知样品产生标准曲线标准品监控试剂、系统阳性对照监控污染阴性对照校正操作误差参比荧光(ROX)降低定量误差3-6复管数据之间可比性内对照(IPC)定量的要素目标基因可以是DNA、cDNA或者质粒；RNA需要先反转录成cDNA；DNA纯度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6~2.0之间=1.8:纯DNA2.0:RNA污染1.6:蛋白质/酚污染DNA用量：基因组DNA：0.1ng–1ug目标基因标准品用来生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系。PCR扩增效率尽量接近，越一致误差越小。同样条件下完成：同样的仪器、试剂、循环参数、同一次实验。同样质量的模板、同样Tm值的引物和探针。标准品PCR效率对定量结果的影响N=NO(1+Ex)nN:numberofamplifiedmolecules;NO:initialnumberofmolecules;n:numberofamplificationcycles;Ex:amplificationefficiency当n=30,Ex=0.95时，N=NO(1.95)30=NOx5.0x108当n=30,Ex=0.90时，N=NO(1.90)30=NOx2.3x108相差2.2倍阳性对照已知必定可以成功、得到扩增曲线的样品用于判断仪器、试剂、操作是否存在问题（假阴性）阴性对照/空白对照除了模板DNA或RNA，具备其他全部成分以水代替模板用于判断系统是否存在污染（假阳性）阳性对照和阴性对照PassiveReferenceDye（ROX)以固定浓度存在于PCR缓冲液中，常用ROX荧光强度归一化校正：Rn=RReporter/RROX影响荧光信号强度的因素包括：激光强度、管盖透光性能缓冲液用量、反应体积、PCR反应强度等是一种综合校正，校正管间差异，保证实验结果的重现性SYBR®GreenI数据的ROX校正熔解曲线的ROX校正TaqMan数据的ROX校正内对照(IPC)同样重量或体积的样品并不来源于同样数目的细胞，即使细胞培养的起始量相同、条件相同IPC一般选用基因组中单拷贝的管家基因，其定量结果代表了基因组的数量，也就是检材中细胞的数量18SrRNA,β-actin,GAPDHCT=CTSmpl-CTIPC将定量结果校正为以基因组为单位，不同样品之间具可比性绝对定量和相对定量绝对定量：确定待测样品中某一目的基因的绝对量值，即确切拷贝数。标准曲线法相对定量：确定待测样品中某一目的基因在不同条件下的表达差异（倍数关系）。双标准曲线法；2-ΔΔc(t)法教学安排定量过程化学原理定量原理的数学依据定量的要素应用实例应用实例定量检测绝对定量：基因表达研究、转基因食品检测、病原体检测相对定量：基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核点突变检测SNP检测与疾病相关的等位基因点突变检测转基因食品检测转基因生物又称遗传修饰生物（GeneticallyModifiedOrganisms，GMO）食物中转基因成分规定：欧盟出台转基因产品的标识制度(1990)，规定0.9%阈值标准（2003)标准品：GMO生物与对应的非GMO生物按不同比例混合，提取DNA；选择目标基因A(只有GMO生物表达)与内标基因B(在GMO和非GMO生物中等量表达)，分别扩增得到不同混合比例下的Ct值。材料RoundupReady大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）普通非转基因大豆从超市买来的测试样品：大豆饼,豆制甜点和两个牌子的大豆粉标准品的制备:转基因成分含量分别为0%,0.1%,0.5%,1%,2%和5%目标基因：EPSPS；内标基因：Lectin转基因大豆检测%GMO=A/B（A,EPSPS;B,lectin)log(%GMO)=log(A/B)=logA-logB=ΔC(t)*MDNAfromStandard/SamplePCRmixGMOprimersTUBE1TUBE2PCRmixLectinprimers转基因大豆检测Standards/SampleC(t)epspsC(t)Lectin∆C(t)0ND22.6ND0.1ND22.6ND0.528.222.55.71.027.222.54.72.026.222.83.45.024.622.71.9SoyDessert24.622.42.1SoyFlourND22.2NDSoyBurger24.223.40.7y=-0.264x+1.202R2=0.998-0.40-0.200.000.200.400.600.800123456∆C(t)LogpercentGMO转基因大豆检测结果Standards/Sample∆C(t)%GMOSoyDessert2.14.40SoyFlourND0.5SoyBurger0.75ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（双标准曲线法/2-ΔΔc(t)法）已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准;选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针双标准曲线Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH肿瘤肿瘤正常正常实验结果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表达MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34±0.1022.83±0.03GAPDH表达实验结果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.0190.0110.0180.018/0.011＝1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionHealthyRNATumorRNA2-ΔΔc(t)法HealthyRNAERBB2GAPDHΔC(t)28.4023.275.1328.4623.415.0528.43±0.0423.34±0.105.09±0.18CarcinomaRNAERBB2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1722.83±0.034.41±0.21ΔΔC(t)=4.41-5.09=-0.68±0.182-ΔΔc(t)=1.41~1.82结果与双标准曲线法相近SNP检测SNP（单核苷酸多态性）人类基因组中的单碱基突变大约93%的基因至少含有一个SNPSNP分型的意义可能引起疾病或疾病的易感性作为基因缺陷型疾病的标志物SNP的漂变可作为进化研究手段药物的抗药性研究SNP检测AACCTGCATAATGCCAGAACCTGCAGAATGCCAG单核苷酸多态性SingleNucleotidePolymorphismsFAM=等位基因II纯合子VIC=等位基因I纯合子FAM+VIC=等位基因I、II杂合子SNP检测（等位基因分型）课后题请简要说明实时荧光定量PCR技术是如何对模板的初始量进行定量的？