烟草农药速测技术研究进展与发展方向

烟草农药残留快速检测技术研究进展与发展方向王全明821010950122010年5月19日摘要：本文综述了速测卡、薄层-酶抑制法、色-质联用、免疫分析和生物传感器等农药快速检测技术，并展望了这一领域的发展方向。关键词：农药残留；快速检测；进展；发展方向在最近的20～25年中，由于环境和食品中的农药残留导致的公共中毒事件屡屡发生，人们对于农药残留的担心与日剧增。烟草作为吸食品，其中的农药残留问题同样引起世界各国的重视。烟草是我国重要的经济作物，目前其病虫害的防治以化学防治为主，而长期使用化学农药就会使病原物的抗药性增加，从而导致化学药剂更大量地使用。这就会造成烟叶中农药残留的增加，致使烟叶农药残留超标，从而成为我国烟草生产贸易中的一个难题。传统的农业残留检测技术技术复杂，花费时间长并且成本高昂，推广起来有很大困难，而快速检测技术简单快速，灵敏度高，特异性强，样品所需量少并且成本低，推广起来有很大优势。为保障人民的身体健康、有效控制农药在烟叶生产中的使用，体现中式烟叶原料的安全性和可用性，就必须认清我国烟草农药残留速测技术研究的现状和发展方向。1．我国烟草农药残留快速检测技术目前，我国烟草农药残留快速检测技术大多是根据有机磷、氨基甲酸酯类农药的毒力，即主要是通过抑制动物神经系统胆碱酯酶活性，造成神经传导介质—乙酰胆碱积累，影响神经正常传导，使动物中毒致死的原理设计而成。其主要方法如下：1.1速测卡法农药速测卡中含有白色和红色两种药片。白色药片中含有胆碱酯酶，它是一种由蛋白质分子构成的生物催化剂，主要分布于动物体神经传导组织，专门催化神经传导介质乙酰胆碱的水解反应。红色药片中含有乙酰胆碱类似物靛酚乙酸酯（红色），靛酚乙酸酯在胆碱酯酶的催化下迅速发生水解反应，生成靛酚（蓝色）和乙酸。有机磷易水解，农药速测卡就是利用有机磷这一特性来检测农药残留量的。只要有微量有机磷存在，就能强烈地抑制蓝色产物的产生，靠肉眼就可从蓝色的深浅来判断农药的残留。对呈阳性结果的样品，可用其它分析方法进一步确定具体农药品种和含量[1-2]。1.2薄层—酶抑制法将农药放在薄层板上展开后，喷酶液，农药抑制斑点上酶活性，而其它部分不被抑制，可以使基质水解，水解产物与显色剂染料发生特定反应，形成某一特定颜色，与农药斑点颜色区分开来。根据检出样品斑点的大小、清晰度与农药标准斑点比较，进行定性分析与概略定量分析。薄层—酶抑制法可采用酶源。植物酶源如面粉酶、玉米面酶、大米（或小米）酶液；动物酶源如马血清、牛肝、蜂脑等。基质通常用乙酸，呈色剂常用蓝光重氮色盐蓝（又称牢固蓝染料）[3-5]。薄层—酶抑制法结合了薄层色谱法和酶抑制方法，对有机磷农药测定灵敏度高、适用性广，同时对样品净化要求不高，与气相色谱法相比，具有技术更容易掌握，不需要贵重仪器等优点，但影响因素很多，如酶液种类、酶液喷洒浓度、显色剂种类等等，使得此法重现性差，所以，采用薄层—酶抑制法时仅能概略定量。1.3色—质联用色—质联用作为一种发展相对成熟的检测手段，在国外的一些报道中，也笼统地将其划为残留速测技术当中的一种手段，它尤其适合于多残留分析。质谱法的优点是，能在多种残留物同时存在的情况下对其进行定性定量分析，仅用气相色谱法检测需要多个检测器，而色—质联用一般只需1次提取和1次GC—MS检测即可。色—质联用法包括气相色谱—质谱联用（GC—MS）和液相色谱—质谱联用技术（LC—MS）。(1)气相色谱—质谱联用技术[6-7]：用气相色谱—质谱联用来检测水果和蔬菜中的邻苯基苯酚、二苯胺及克期特等。其残留用乙脂提取，再转移至丙酮中，邻苯基苯酚、二苯胺回收率比较高。该法可用来检测土壤中的痕量农药，适合于研究污染源在环境中的行为。气相色谱—化学电离质谱法可用来分析水果和蔬菜上多种致癌农药的残留量，如高灭磷、丁草胺、谷硫磷、敌菌丹、克菌丹、杀虫腺、百菌清、禾草灵、烯氟乐灵、异丙甲草胺、恶草灵等。(2)液相色谱—质谱联用技术：大部分农药可用GC—MS检测，但对极性或热不稳定性太强的农药（及其代谢物）不适用（如灭菌丹、利谷险、黄草消等），可采用高效液相色谱—质谱来检测[8]。据统计，液相色谱可以分析的物质约占世界上已知化合物的80%以上，内喷射式和粒子流式接口技术可将液相色谱与质谱连接起来，已成功用于分析一些对热不稳定、分子量较大、难以用气相色谱分析的化合物；且具有检测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等特点。1.4免疫分析法免疫分析法是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。免疫是机体识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性应答反应。近年来，免疫分析法尤其是酶免疫分析的研究十分活跃，应用领域也取得了较大的扩展[9]。免疫分析法(IA)被称为使用抗体作为“生物化学检测器”的分析技术，是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法。大分子量的农药（如苏云金杆菌毒素等）可以直接作为抗原免疫脊椎动物，动物的免疫系统对进入体内的异源大分子量物质发生保护性应答反应。小分子量农药一般不具备免疫原性，不能刺激动物产生免疫反应，但有与相应抗体在体外发生吸附反应的能力，即有反应原性，这类小分子物质在免疫学上称为半抗原。将农药小分子通过一定碳链长度的连接分子与分子量大的载体（一般为蛋白质）以共价键相偶联制备成人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反应，产生对农药具特异性的活性物质（免疫球蛋白或称抗体）来识别该农药分子并与之结合，这种结合反应不仅可在体内进行，也可在体外进行，符合质量作用定律，这就是免疫分析的基础[10-11]。免疫分析法有荧光免疫测定法、酶免疫测试法、放射免疫测定法、流动注射免疫分析等。1.5生物传感器法传感器法是将传感技术与农药免疫分析技术相结合而建立起来的，可以说它是免疫分析技术的一种延伸或分支。应用在痕量分析上的有生物传感器和固相传感器[2]。生物传感器是由一种生物敏感部件与转换器紧密配合，对特定化学质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。简单的生物传感器如温度敏感指示物，复杂的如圆4A—RYA探针[12]。传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间（如酶与底物、抗体与抗原、外源凝聚素与糖、核酸与其互补片段之间）的识别反应会产生一些物理化学信号（如光、热、声、质量、颜色、电化学等）的变化，这些变化通过不同原理的转移器（如光敏管、压电装置、光极、热敏电阻、离子选择性电极等）转换成第2信号（通常为电信号），经放大后显示或记录。按照生物功能区分，生物传感器包括酶传感器、组织传感器、微生物传感器等。第1代生物传感器的主要特征是将生物技术与微电子技术相结合，如光导纤维生物传感器[13]。在传感技术中，除生物传感可用于农药残留检测外，还有固相传感技术，它通常用压电结晶，即当附加电压时，晶体震动的能力取决于晶体的质量和大小。晶体上包被了能吸附目标物的材料。当晶体与配基接触时就会发生吸附，随之晶体的质量和频率发生变化。频率的改变与吸附在晶体上物质的含量有关，依此进行定量测定。总之，在农药残留分析技术研究中，农药速测技术是一个重要分支。仪器分析法可以保证数据的精确性和准确性，相对来说，其流程仍比较烦琐，但在残留分析技术中，其地位仍是不可取代的。免疫法的开发过程需投入较多资金和较长时间，但具有简单、快速、灵敏高度、特异性强、价廉、样品所需量少等优点，其灵敏度与常规的仪器分析一致，且适合现场筛选。生物传感器是高科技的产物，它能很快地测定蔬菜水果上的农药及其他化学污染物，操作更加方便，且可以重复使用。农药速测技术快速、灵敏、简便的优点，使之在果蔬中农药残留分析有重要的使用价值。2烟草农药残留检测技术展望农药残留检测技术发展到今天，已经取得重大进展，特别是样品前处理技术的发展，各种不同仪器技术的应用，大大提高了农药残留检测能力和检测的灵敏度、检测限和检测覆盖范围，为检测质量控制搭建了技术平台。科学无止境，追求无极限，实施快速检测、在线检测战略，研发精准仪器，强化质量控制，仍然是国际上提高农药残留检测水平的重要课题[14-15]。2.1完善快速检测技术采用现场快速初筛检测和实验室验证性检测结合，对结果阳性的样品用准确、可靠的色谱法进行验证，可大大减少分析工作量，提高分析效率，有利于加强农药残留监控的力度。但各类快速检测方法在应用过程中仍存在不少问题:如酶抑制法容易出现假阳性、假阴性，植物内含物对酶反应干扰严重，不同批次酶的质量、反应温度、处理时间等对检测结果影响较大，导致检测的专一性、可比性等下降；酶联免疫法在分析过程中出现交叉反应，导致检测的可靠性和灵敏度降低，方法难以标准化;活性生物测定法不能分辨农药残留的种类；生物传感测定存在选择性不高等问题。针对这些现象，快速检测技术还应向着稳定性好、灵敏度高的方向发展。2.2突破在线检测技术在农药残留检测中，烦琐冗长的样品前处理过程，一直困扰着检测工作的进展。样品前处理产生误差的机率最高，欲获一个快速、准确、规范的分析方法，必须省去转移、浓缩等容易造成损失的中间步骤。各种在线联用技术可避免样品转移的损失，减少各种人为的偶然误差，将是农药残留分析方法研究的重点。现已有公司研发出包括用于样品处理和用于在线分离色谱的自动化装置。如SPE-HPLC、HPLC-GC、SPME-GC联用的完全自动化的在线系统。但目前研发的在线检测系统只是有成功的个例，还存在许多技术上有待突破的地方。2.3提高测定复杂样品的能力随着使用农药的转型，高毒小分子化学农药的退出和生物农药的兴起将使其应用更加广泛，今后分析重点将转向与生物组织成份很难区分的生物大分子农药，生物农药的检测将提上日程。农药分析样品污染源的未知性，注定了检测应朝多元化的方向发展，对检测工作者不断提出新的挑战。如核磁共振（NMR）是最强有力的测定未知化合物结构的方法之一。HPLC-NMR-MS可以进行复杂混合物的分离和检测，分辨率很高，并且可以测定未知物的完全结构。目前已有HPLC-NMR联机技术的报道，但在农药残留方面的应用尚不多见，在将来，HPLC-NMR和HPLC-NMR-MS等系统化的处理复杂样品的测定技术仍是今后农药检测的趋势。参考文献：[1]李顺，纪淑娟，李东华.酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的最佳条件研究[J].食品科技，2007(1):171-173.[2]袁倬斌，张君，黄鸿年.用于农药残留检测的掌上型有机磷农药检测仪[J].生命科学仪器，2004，6(3):31-32.[3]土恒亮，张保民，王兰芝等.酶活性抑制测定农药残毒技术研究[J].河南农业科学，1997(1):25-26.[4]蒙绮劳，周锡良，奚定平.洲量农药和乙酰胆碱酯酶抑制物光化学式生物传感器[J].化学传感器，1996，16(3):192-195.[5]温艳霞，李建科.酶抑制法在农残检测中的应用及乙酰胆碱酯酶的研究进展[J].食品研究与开发，2005，26(1):130-131.[6]王运浩，江用文，成浩.食品农药残留与分析控制技术展望[J].现代科学仪器，2003，(1):8-12[7]王建，林秋萍，雷莉等.气相色谱—质谱法测定蔬菜中有机磷杀虫剂和克百威的残留量[J].分析试验室，2002，21(2):27-30[8]HARMANNH，BURHENNEJ，MULERK，etal.Rapidtargetanalysisforpesticidesinwaterbyonlinecoatedcapillarymicro-extractioncombinedwithliquidchromatographyandtandemmassspectrometry[J].JournalofAOACInternational，2000，83(3):762-770.[9]韩丽君，钱传范，李文明.酶联免疫吸附分析法测定黄瓜中的甲基对硫磷[J].农业基础科学，2006，21(6):146-149.[10]黎媛萍，曾光明，汤琳.间接竞争ELISA法测定稻田土壤中除草剂毒莠定的残留量[J].环境科学学报，2007，27(7):1222-1226