胰岛素生产流程图

胰岛素(E.Coli)生产流程人胰岛素—碳水化合物代谢和体细胞供能一级结构：51个氨基酸双链（A：21，B：30）分子量：5734g/mol等电点：5.4胰岛素产生受损导致糖尿病人胰岛素的制备方法•人胰腺提取---原料来源有限•通过单个氨基酸化学合成---生产成本太高•猪胰岛素转化或“半合成”--成本高，来源少•基因工程菌发酵--双链—Genentech,开发，EliLilly放大--胰岛素原（82个氨基酸，胰岛素的前体）--分泌法（Yeast），NovoNordisk产业化--细胞内法（E.coli），表达121+82个氨基酸的Trp-LE’-Met-proinsulin包涵体，EliLilly产业化E.Coli胰岛素原法转化流程市场分析和设计基础（2005）•糖尿病人数：美国1800万，全世界1.5-2.0亿，年增长率3-4%•胰岛素年销售额35-40亿美元,由NovoNordisc、EliLilly和SanofiAventis三家垄断•每个患者每年购买胰岛素的花费：$250-750•每个病人每年平均用量：0.5克纯胰岛素•对1.5-2.0亿患者，年需求75-100吨纯胰岛素•目前年产量20-30吨纯胰岛素•设计年产量：1800kg纯胰岛素，满足350万人•年工作330天，每48小时生产一批次，每年160批次•每批次发酵液体积：37.5立方米，•发酵罐空罐体积：50立方米人重组胰岛素（E.coli）生产流程•发酵工段•初回收工段•反应工段•终纯化工段P-1/V-101MixingP-2/ST-101HeatSterilizationP-3/MX-101MixingP-4/G-101CentrifugalCompressionP-5/AF-101AirFiltrationP-6/AF-102AirFiltrationP-7/V-102FermentationP-9/DS-101CentrifugationP-11/HG-101HomogenizationP-13/DS-101CentrifugationP-14/DS-101CentrifugationP-16/DF-101DiafiltrationP-17/DE-101Dead-EndFiltrationMediaS-102S-106S-107S-108AirS-110AmmoniaWFI-1S-132LiqWaste4LiqWaste5WaterP-19/V-106StorageS-101S-104P-8/V-103IBSolubilizationS-109S-115P-15/V-103CNBrCleavageS-111S-121CNBr/HCOOHMrETOH/UreaLiqwaste1LiqWaste2S-114LiqWaste3P-18/CSP-101RotaryEvaporatorS-117P-20/V-105SulfitolysisGuanHClP-21/DF-101DiafiltrationWFI-2LiqWaste6P-23/V-107RefoldingP-24/DF-102DiafiltrationP-26/V-108EnzymeConversionP-27/DF-102DiafiltrationP-29/DF-103DiafiltrationP-31/C-105GelFiltrationP-34/BCF-101BasketCentrifugationP-35/FDR-101FreezeDryingS-127S-128S-129P-36/C-101S-SepharoseP-22/C-102HICColumnP-25/C-103S-SepharoseP-28/C-104RP-HPLCS-135S-136LiqWaste7S-141WFI-3P-30/DF-103DiafiltrationMrEtOHLiqWaste8S-146S-147S-148LiqWaste9S-150S-151EnzymesS-153WFI-4LiqWaste10S-156LiqWaste11S-158S-159S-160S-161WFI-5LiqWaste12S-165S-166S-167LiqWaste13WFI-6LiqWaste14S-172S-173S-174S-175LiqWaste15S-186ProductS-123LiqWaste17FermentationSectionPrimaryRecoverySectionReactionsSectionFinalPurificationSectionP-38/V-109Blending/StorageEDTASolutionS-138S-142P-10/V-110Blending/StorageS-118Triton-X-100S-125S-143S-119S-144S-149S-152S-154P-12/V-111CrystallizationS-126S-157S-137P-33/DF-104DiafiltrationS-124LiqWaste16S-162S-130P-1/V-101MixingP-2/ST-101HeatSterilizationP-3/MX-101MixingP-4/G-101CentrifugalCompressionP-5/AF-101AirFiltrationP-6/AF-102AirFiltrationP-7/V-102FermentationMediaS-102S-106S-107S-108S-110AmmoniaWaterP-19/V-106StorageS-101FermentationSection通气量：0.5VVM空罐体积：50立方米前接2级种子罐发酵周期：18小时发酵温度：37度终菌密度：30克（干重）/升包涵体含量：干重的20%终保温：10度发酵工段初回收工段—物料温度保持10度P-9/DS-101CentrifugationP-11/HG-101HomogenizationP-13/DS-101CentrifugationLiqwaste1LiqWaste2PrimaryRecoverySectionP-38/V-109Blending/StorageEDTASolutionS-138S-142P-10/V-110Blending/StorageS-118Triton-X-100S-125--三个平行的碟片式离心机收获菌体--菌液从37000L浓缩到9165L菌泥--菌体收率98%加与菌泥等体积的缓冲液(96.4%w/wWFI注射用水,0.7%EDTA,和2.9%TRIS-base)稀释,有利于菌体碎片与包涵体分离三次高压匀浆机破菌释放包涵体压降800bar终物料体积：1400L用前面的碟片式离心机回收包涵体收率98%加2倍体积的清洗剂(0.66%Triton-X100),洗涤包涵体反应工段—溶解包涵体P-14/DS-101CentrifugationP-16/DF-101DiafiltrationP-17/DE-101Dead-EndFiltrationWFI-1S-132LiqWaste4LiqWaste5P-8/V-103IBSolubilizationS-115S-114LiqWaste3S-130玻璃反应釜内加终浓度为300g/L(5M)的尿素（溶解变性蛋白）和40g/L的2-巯基乙醇（减少二硫键的结合）反应时间：8小时溶解收率：95%包涵体内Trp-LE’-Met-proinsulin含量：80%w/wWFI透析6小时，收率98%，去除尿素和2-巯基乙醇过滤去除细小颗粒，保护后续层析柱。终体积5200L再次离心，去除菌体碎片和可溶性蛋白共用前面回收工段的碟片离心机反应工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个氨基酸的Trp-LE’-Met和82个氨基酸的ProinsulinP-15/V-103CNBrCleavageS-111CNBr/HCOOHP-18/CSP-101RotaryEvaporatorS-117P-20/V-105SulfitolysisGuanHClP-21/DF-101DiafiltrationWFI-2LiqWaste6S-127S-128S-12970%甲酸溶液30倍过量加入CNBr(理论摩尔比1:1)收率95%反应时间：12小时反应温度：20度利用前面溶解反应釜在CNBr沸点35度旋转真空蒸发1小时会产生少量有毒氰化物气体，现场应准备次氯酸盐亚硫酸分解的目的是打开胰岛素原和二硫键，给半胱氨酸加上SO3部分pH9-11，50%w/w(6M)盐酸胍，0.35%碳酸氢铵，3%硫酸钠，1.5%过硫酸钠，反应时间12小时，收率95%WFI透析至盐酸胍浓度为20%w/w共用前面包涵体溶解过程的透析器反应工段—再折叠P-23/V-107RefoldingP-24/DF-102DiafiltrationP-36/C-101S-SepharoseP-22/C-102HICColumnS-135S-136LiqWaste7S-141WFI-3MrEtOHLiqWaste8S-146S-147S-148LiqWaste9S-123ReactionsSectionS-119S-144S-149S-152三个平行阳离子交换层析床纯化proinsulin床直径：140cm床高度：25cm填料：SPSepharoseFF,GE洗脱液：29%w/w尿素，1.5%NaCl,69.5%WFIpH4收率90%再折叠的目的是去除SO3，然后使二硫键形成，并再折叠成胰岛素原的正确天然结构加入巯基乙醇反应工段—酶转化P-26/V-108EnzymeConversionP-27/DF-102DiafiltrationP-25/C-103S-SepharoseS-151EnzymesS-153WFI-4LiqWaste10S-156LiqWaste11S-154终纯化工段P-29/DF-103DiafiltrationP-31/C-105GelFiltrationP-28/C-104RP-HPLCP-30/DF-103DiafiltrationWFI-5LiqWaste12S-165S-166S-167LiqWaste13WFI-6LiqWaste14S-172S-173S-174S-175FinalPurificationSection终纯化工段P-34/BCF-101BasketCentrifugationP-35/FDR-101FreezeDryingS-186ProductLiqWaste17P-12/V-111CrystallizationS-126S-157S-137P-33/DF-104DiafiltrationLiqWaste16S-162P-1/V-101MixingP-2/ST-101HeatSterilizationP-3/MX-101MixingP-4/G-101CentrifugalCompressionP-5/AF-101AirFiltrationP-6/AF-102AirFiltrationP-7/V-102FermentationP-9/DS-101CentrifugationP-11/HG-101HomogenizationP-13/DS-101CentrifugationP-14/DS-101CentrifugationP-16/DF-101DiafiltrationP-17/DE-101Dead-EndFiltrationMediaS-102S-106S-107S-108AirS-110AmmoniaWFI-1S-132LiqWaste4LiqWaste5WaterP-19/V-106StorageS-101S-104P-8/V-103IBSolubilizationS-109S-115P-15/V-103CNBrCleavageS-111S-121CNBr/HCOOHMrETOH/UreaLiqwaste1LiqWaste2