海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术

中国海洋大学硕士学位论文海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术姓名：戈蕾申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：黄倢;李琪20070604海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术作者：戈蕾学位授予单位：中国海洋大学相似文献(5条)1.期刊论文王洪月.袁野.周群兰.朱健.崔玉东.王秀利.WangHongyue.YuanYe.ZhouQunlan.ZhuJian.CuiYudong.WangXiuli致病性弧菌主要毒力相关因子的研究进展-生物技术通报2009,(z1)弧菌(Vibrio)是一种革兰氏阴性短杆菌,其广泛分布于自然界,以水中最多.弧菌是引起人类、水生动物细菌性疾病的重要病原之一.弧菌的致病性与各个毒力基因的协同作用密切相关.弧菌的毒力因子主要可分为粘附素、内毒素、外毒素等.本文主要对致病性较强的毒力因子粘附素和外毒素进行阐述,以期为弧菌致病机理的研究及弧菌病的防治提供参考和借鉴.2.学位论文李香平宁波地区副溶血弧菌血清型和部分毒力基因的分布研究2008副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)为革兰氏阴性的短杆菌，常存在鱼类和贝类等海产品中，分布于海岸线等世界各地。在沿海地区和国家，副溶血弧菌是引发食性疾病的重要病原菌。研究数据表明，50％-70％因食用海产品引发的腹泻病例是由副溶血弧菌引起的。此菌主要通过消化道感染，患者出现腹泻、腹部痉挛、恶心、呕吐、发热，甚至脱水、昏迷等症状。副溶血弧菌也是我国海水养殖鱼、虾、贝类的重要病原，每年由此菌引起的弧菌病给养殖业造成严重的损失。在浙江省沿海网箱养殖中，该菌与哈维氏弧菌、溶藻弧菌等重要病原弧菌一起，主要危害大黄鱼幼鱼，每年的高温季节可引起大量的死亡。致病微生物的快速检测与分离技术是致病微生物研究的热点之一。PCR能快速检测食品中存在的致病微生物，是一种有效的快速检测手段。建立副溶血弧菌的快速简便的鉴定和分子分型方法，对于开展海产品生产加工过程中副溶血弧菌污染源调查和控制，提高食品的微生物卫生质量具有重要意义。本文以具有副溶血弧菌种特异性的毒力调控基因toxR基因，建立聚合酶链式反应(PCR)方法以鉴别海产品中分离的的副溶血弧菌。71株分离菌以toxR基因为靶基因均能扩增出340bp的目的片段，并且存在于所有的分离菌株中，具有良好的保守性。以toxR作为靶基因的PCR法快速鉴定副溶血弧菌，灵敏度高、一致性和特异性较好。副溶血弧菌具有多种毒力因子，致病菌株能够产生热稳定性溶血素有热稳定直接溶血素(thermostabledirecthemolysin，TDH)、热不稳定溶血素(thermolabilehemolysin，TLH)和相对热稳定直接溶血素(TDH-relatedhemolysin，TRH)。研究宁波地区副溶血弧菌不同血清型菌株主要毒力基因的分布情况，从贝类中分离并鉴定副溶血弧菌，得到副溶血弧菌菌株71株，并对主要毒力基因(TLH，TRh，TDH，toxR)进行了PCR检测。结果表明所有菌株均能扩增出340bp左右的toxR基因片段，除了参考菌株BJI.1997以外，所有菌株均没有扩增出TRH基因片段，所有菌株均KP阴性并没有扩增出269bp左右的TDH片段，TLH存在于所有分离菌株中。参照GBPT478917-2003用标准血清进行副溶血弧菌血清学试验，用最小抑菌浓度(MIC)法进行了氨苄青霉素、硫酸新霉素、硫酸庆大霉素、壮观霉素、卡那霉素、硫酸土霉素、硫酸链霉素、盐酸四环素、利福平等对四种不同血清型的副溶血弧菌的药敏试验。结果表明分离到的20株副溶血性弧菌主要分属于2个血清群，分别为O1群占50％(10/20)、O5群占15％(3/20)，有35％(7/20)的菌株出现自凝现象。药敏试验结果显示：副溶血弧菌O1:KIII对卡那霉素敏感，所有菌株对氨苄青霉素耐受，对硫酸新霉素(NeomycinSulfate，NEO)和硫酸链霉素(StreptomycinSulfate，STR)敏感性无显著差异(t测验，P0.05)。经过96h鱼类急性毒性试验，检测不同副溶血弧菌血清型对异育银鲫的毒性。结果表明，不同血清型的副溶血弧菌对异育银鲫的毒性大小差异不显著。利用不同血清型的副溶血弧菌的福尔马林灭活全菌苗(FKC)注射异育银鲫，检测不同血清型菌株之间的免疫原性。结果表明，副溶血弧菌的福尔马林灭活全菌苗(FKC)能够有效的刺激抗体的产生，不同血清型的菌株之间的交叉抗体效价较低。福尔马林灭活的全菌苗能显著提高受免鱼白细胞的吞噬活性和溶菌酶活性(t测验，P0.05)。副溶血弧菌的福尔马林灭活全菌苗(FKC)能够起到良好的免疫保护作用。3.学位论文王影利用抑制性消减杂交(SSH)技术研究鳗弧菌不同毒力菌株的基因多样性2009鳗弧菌(Vibrioanguillarum)是一种引起鱼类弧菌病的重要的条件性致病菌，在世界各地流行，能感染八十余种海洋及河口鱼类，也是我国海水养殖的花鲈、牙鲆、大菱鲆等动物的重要病原菌，常给水产养殖业造成较大的危害，因此对该菌毒力相关因子的研究对于其防治具有重要的意义。目前已发现的鳗弧菌毒力因子主要有金属蛋白酶(metalloprotease)、铁载体(siderophore)及外膜蛋白(outermembraneprotein，OMP)等。然而，总体来说对鳗弧菌众多毒力因子的研究大多数集中在强毒株上，而对弱毒株或无毒株的报道极少，这就为毒力因子的鉴定带来了困难。而且强毒株、弱毒株和无毒株之间的毒力差异不能用目前这些已知因子的有无加以解释，因而推测有其它因子导致其毒力差异。遗传关系密切而又具有一定生物学特征差异的两种或两株细菌的比较基因组学研究受到普遍重视，因为在某一菌株存在而在另一菌株缺失的基因可能具有很重要的分子生物学意义。抑制性消减杂交技术(suppressionsubtractivehybridization，SSH)是抑制性PCR和消减杂交技术相结合的简单快速的分离筛选差异基因的方法。它利用强毒株作为检测子(tester)，弱毒株或无毒株作为驱动子(driver)，将强毒株与弱毒株基因组一致的大量冗余部分去除，提炼出更具有研究价值的信息。消减杂交通过对强毒株及弱毒株的差异显示使研究方向更具针对性，消减杂交的片段可以作为候选的毒力相关因子的标志，让我们距离事实真相更近一步，具有简单易行、特异性高、能分离出低丰度差异片段等优点。两株鳗弧菌菌株VIB72和CW1对斑马鱼(Brachydaniorerio)存在明显的毒力差异(菌株VIB72的LD50=4.17×103cfu/perfish；菌株CW1的LD50=2.14×106cfu/perfish)。本研究从两株鳗弧菌菌株的毒力差异出发，采用抑制性差减杂交技术构建特异性的DNA差减文库，将消减文库中特异表达的DNA片段插入载体，转化大肠杆菌，扩增文库后，经蓝白斑和抗生素初步筛选，随机挑取白色克隆进行菌落PCR分析插入片段，通过菌落PCR从384个随机挑选的差减文库克隆中筛选出187个阳性克隆，占总数的48％。经过斑点杂交进一步筛选出59个差减克隆的插入片断，这些片段只存在于菌株VIB72中而在菌株CW1中缺失，并对成功测序的55个片断进行同源性分析，这55个片断中有30个(约占55％)与已知蛋白或假定蛋白的编码基因有序列同源性，其中17个与已知蛋白的编码基因有序列同源性。这些已知蛋白有：可溶性溶胞壁质转糖基酶、转移蛋白MobA和MobC、转座酶IS66、抗性相关蛋白(金属β－内酰胺酶和乙酰转移酶家族)、毒素蛋白(DT－201和alveicinA免疫蛋白)、与OLD家族相似的ATP依赖性核酸内切酶以及SocE和GTP结合蛋白HflX(有高频率的溶原化)，这些蛋白中绝大多数在其他细菌中有一定的毒力作用，但在鳗弧菌中还是第一次被发现。由此可以推断，这些基因片断有可能是鳗弧菌毒力岛的一部分，其完整基因编码的蛋白因子极有可能在鳗弧菌致病过程中能发挥巨大作用。这些片断的发现为进一步研究该菌的致病机理奠定了良好的基础。此差减文库的构建将减少克隆鳗弧菌毒力相关基因的盲目性。本研究发现的潜在毒力基因片段，可借助染色体步移等技术，克隆出其完整的毒力基因，为进一步研究该菌的致病机理奠定良好的基础。同时以上毒力基因片段亦可用于鳗弧菌毒力菌株和非毒力菌株的鉴别。4.期刊论文陆吉虎.李槿年.张传亮.LUJi-hu.LIJin-nian.ZHANGChuan-liang病原弧菌毒素共调菌毛研究进展-动物医学进展2007,28(8)毒素共调菌毛(Tcp)是由分子质量约23ku的TcpA以及TcpB、TcpC、TcpQ、TcpF等亚单位组成的存在于弧菌表面的一种丝束状物,属于Ⅳ型菌毛,为弧菌的主要黏附定居因子之一.Tcp是病原孤菌致病过程中的重要黏附素,具有组织细胞黏附性和血凝性,并通过激活或上调其他毒力基因的表达参与细菌的致病过程.Tcp也是一种重要的保护性抗原,能够刺激动物机体产生特异性抗体从而抑制病原孤菌的黏附感染.ToxR、ToxT和ToxS等因子分别或协同调控TcpA的转录与表达,而TcpP/H则是联系环境信号与ToxT表达之间的纽带.TcpA疫苗对试验小鼠具有较高的免疫保护力,Tcp黏附素疫苗的研制对防治动物弧菌病具有重要意义.5.学位论文钱荣华溶藻弧菌主要毒力相关基因的克隆、表达及其免疫原性研究2007溶藻弧菌是人和海洋动物共感染的一种主要病原弧菌，广泛分布于海洋和河口，是中国四大海产经济鱼类之一的大黄鱼危害最严重的一种主要病原菌。可引起鱼体伤口感染、炎症反应和败血症等症状，发病率高，流行面广，造成经济损失巨大。本论文主要从溶藻弧菌主要毒力相关基因着手，通过克隆构建和体外表达，以表达的重组蛋白为抗原，制备基因工程亚单位疫苗，对由溶藻弧菌引起的大黄鱼弧菌病进行免疫预防研究。用分离菌株ZJ04107和溶藻弧菌标准参考株17700进行人工感染试验，结果证明ZJ04107菌株是大黄鱼的病原菌。经进一步的生理生化鉴定和16SrRNA基因序列的分子水平鉴定，结果表明分离株ZJ04107为溶藻弧菌。分离株ZJ04107的LD,50为2.0×10'7CFU，标准参考株17700为8.0×10'7CFU。药敏试验结果表明：头孢曲松、复方新诺明、依诺沙星、氧氟沙星、四环素和壮观霉素对该分离菌有明显的抑制作用。克隆到溶藻弧菌6个主要毒力相关基因：铁调蛋白基因(fur)、鞭毛蛋白基因(flαA)、胶原酶基因(valC)、碱性丝氨酸蛋白酶基因(aspA)、外膜蛋白OmpK基因(ompK)和OmpW基因(ompW)。上述基因编码相应成熟蛋白(16.8kDa、39.8kDa、89kDa、56kDa、31.3kDa和23.3kDa)的基因片段分别亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)，构建重组表达质粒(pET-Fur、pET-F1aA、pET-ValC、pET-AspA、pETl-OmpK和pET-OmpW)。SDS-PAGE结果表明，各重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中获得大量表达。带His-Tag的重组蛋白经镍亲和层析得到纯化，Westernblot分析结果显示，各重组蛋白具有免疫反应性。应用生物信息学方法和相关软件，对6个主要毒力相关基因编码蛋白的高级结构分别进行了同源比较建模，预测到各蛋白质的三级结构模型，有助于进一步研究各蛋白的相关功能。应用重叠延伸剪切技术，将aspA和ompW二个基因，分别经三次PCR获得融合基因片段aspA-ompW和ompW-aspA，定向插入原核表达载体pET-30a(+)中，筛选阳性克隆，经酶切及PCR鉴定，并通过DNA测序证实，成功构建了融合基因原核表达质粒pET-AspA-OmpW和pET-OmpW-AspA。融合基因质粒在大肠杆菌中获得表达，重组融合蛋白经镍亲和层析得到进一步纯化，Westernblot分析结果显示，二种融合蛋白都具有免疫反应性。将各主要毒力相关基因表达的重组蛋白(FlaA、AspA、OmpW、OmpK、OmpW-AspA)及四种