生物药物的分离纯化技术

生物药物的分离纯化技术LOGO•研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术，是一门应用性很强、科技含量较高的学科，涉及到物理、化学、生物学等方面的知识和操作技术。第一节绪论LOGO基本涵义•生物分离技术是指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。LOGO主要内容•包括离心分离、过滤分离、泡沫分离、萃取分离、沉淀（析）分离、膜分离、层析（色谱）分离、电泳分离技术以及产品的浓缩、结晶、干燥等技术。LOGO基本原理•主要是依据离心力、分子大小（筛分）、浓度差、压力差、电荷效应、吸附作用、静电作用、亲和作用、疏水作用、溶解度、平衡分离等原理对原料或产物进行分离、纯化。不同的分离对象需要采用不同的分离方法才能有效地被分离。LOGO发展历史生物分离技术至今已有几百年的历史。①16世纪人们发明了用水蒸气蒸馏从鲜花与香草中提取天然香料的方法；②近代生物分离技术是在欧洲工业革命以后逐渐发展形成的；到20世纪40年代初，大规模深层发酵生产抗菌素；③近年来发展的新生物技术包括利用基因工程菌生产人造胰岛素，人与动物疫苗等产品，某粗产物的含量极低，而对分离所得最终产物的要求却更高了。LOGO生物分离的基本过程•生物分离工艺流程：•一般包括原料的选取、预处理、细胞破碎、固-液分离、初步纯化（分离）、精制（高度纯化）和成品加工等过程。LOGO发酵液（培养液）胞外产物预处理固-液分离细胞破碎胞内产物固-液分离初步纯化精制成品加工动植物原料细胞破碎萃取与预处理沉淀分离静态吸附静态离子交换萃取分离膜分离吸附层析离子交换层析凝胶层析亲和层析疏水层析高效液相色谱脱盐、浓缩结晶、干燥图1-1生物分离的一般工艺过程LOGO生物分离的各阶段的常用方法发酵液的预处理•加热、调pH、絮凝和凝聚。固液分离•沉降、离心分离、过滤、错流过滤。LOGO细胞破碎•机械法：高压匀浆、高速珠磨、超声波破碎；•非机械法：化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法。LOGO初步纯化•沉淀法、吸附法、萃取法、超滤法高度纯化•吸附层析、亲和层析、凝胶层析、离子交换层析、电泳、结晶和重结晶。LOGO成品加工•无菌过滤、去热原、干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、制剂。LOGO生物分离技术的特点•1、需要对目标产物的快速分离纯化•2、需要对原料液进行高度浓缩•3、需要借助新型的分离技术和材料•4、需要除去有害人类健康的物质•5、采用利于保持目标产物产品质量的操作条件•6、产品要求高质量、高纯度因此，生物分离过程往往成本很高，在某些产品的生产过程中，分离成本可能占到总成本的80％以上。LOGO生物分离方法的选择•对于一个未知化学结构和性质的组分的分离制备设计，大致可按以下六个基本步骤进行：•1、查找与待分离组分相关的基础性研究资料，建立相应的分析鉴定方法；•2、开展制备物的理化性质稳定性的预备试验；•3、开展材料处理及抽提方法的选择试验；•4、进行分离纯化方法、程序的摸索及其分离效果的评价；•5、进行产物均一性的测定；•6、进行中间试验和工业生产应用的放大设计，确定最佳的分离方法。第二节发酵液的预处理LOGO预处理的目的•1.分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物）。•2.除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。LOGO预处理的方法•（一）发酵液过滤特性的改变•（二）发酵液的相对纯化LOGO发酵液过滤特性的改变微生物发酵液的特性为：发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。LOGO改善发酵液过滤特性的物理化学方法•调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。LOGO1.降低液体粘度•根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。LOGO2.调节pH•pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。LOGO3.凝聚与絮凝•采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。LOGO•（1）凝聚指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。•发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。LOGO主要是无机类电解质，大多为阳离子。常用的凝聚剂电解质：•硫酸铝Al2(SO4)3•18H2O；•氯化铝AlCl3•6H2O;•三氯化铁FeCl3;•硫酸亚铁FeSO4·7H2O；•石灰；ZnSO4；MgCO3LOGO•（2）絮凝•指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。•采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。LOGOLOGO絮凝剂•是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。LOGO•它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。•当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。LOGO•工业上使用的絮凝剂可分为三类：•1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；•2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；•3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。LOGO医药和食品工业：•聚丙烯酸类阴离子絮凝剂•聚苯乙烯类衍生物•无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等）•天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）LOGO•（3）混凝•对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；•对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。LOGO•4.助滤剂•一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。•悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。常用的助滤剂有：硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。LOGO•5.反应剂•加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。•生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能。LOGO发酵液的相对纯化发酵液中的杂质：•（1）高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）•在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。LOGO•（2）杂蛋白•在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，•在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。•在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。LOGO高价无机离子的去除方法•Ca2+——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀；•Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；•Fe2+——黄血盐，→普鲁士兰沉淀LOGO杂蛋白的去除方法等电点沉淀法化合沉淀法变性法吸附法LOGO等电点沉淀法•蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。•在酸性溶液中带正电荷；在碱性溶液中带负电荷。•在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。LOGO化合沉淀法•酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。•在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；•在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。LOGO变性法•热变性：适于热稳定物质•大幅度调节pH：根据产物特性反向调节•加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等LOGO缺点：•加热法只适合于对热较稳定的目的产物；•极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；•有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。LOGO吸附法•加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。①在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；②在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。LOGO思考题1.生物分离技术的特点有哪些？2.为什么要进行发酵液预处理？3.絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝剂有哪些？