抗体库技术

第十三章抗体库技术鲍永华([e-mail])新乡医学院免疫学教研室NielsK.JerneGeorgesJ.F.KöhlerCésarMilstein丹麦CAntigenBADBCADabcdAntibodyaAntibodybAntibodycAntibodyd多克隆抗体的制备单克隆抗体的制备基因工程抗体技术20世纪80年代,DNA重组技术发展使制备部分或全部人源化的基因工程抗体成为可能，因此产生了基因工程抗体技术。第一节抗体库技术进入20世纪90年代，组合化学技术与基因工程抗体技术相互结合产生了抗体库技术。从此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。抗体库技术的产生基于两项关键技术的突破：①PCR技术的出现和发展使人们能够使用一套引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因;②利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体分子片段。概念所谓抗体库(antibodylibrary)技术,就是用基因克隆技术克隆全套抗体重链和轻链可变区基因,然后重组到特定的原核表达载体中,再转化大肠杆菌以表达有功能的抗体分子片段,并通过亲和筛选获得特异性抗体可变区基因的技术。抗体库技术经历了组合抗体库、噬菌体抗体库、核糖体展示(ribosomedisplay)抗体库3个发展阶段。英国剑桥的Ward等最早尝试了抗体库的构建，他们用PCR从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA扩增出VH基因,测序证实了其多样性,在大肠杆菌表达出VH段(单区抗体),检测2000个克隆得到21个可以与溶菌酶特异结合的克隆。这一工作未构建完整的抗原结合部位(无轻链),也未提出有效的筛选方法,但它表明了抗体库技术的可行性。2个月之后，Science上发表了美国Scripps研究所Huse等的完整的抗体库工作,他们用逆转录-PCR技术从淋巴细胞克隆出抗体轻链基因repertoire和重链Fd段基因repertoire,将两者分别组建到噬菌体表达载体中（如下图）。组合抗体库的表达载体Fab=VL+CL(L)VH+CH1(Fd)Fab片段结合抗原Fc=CH2+CH3A：重链载体B：轻链载体C：组合后的Fab段表达载体抗体库技术较细胞融合杂交瘤技术制备单抗有着明显的优越性：1.抗体库技术省去了细胞融合的步骤,省时省力,避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。2.扩大了筛选容量,用杂交瘤技术一般筛选能力在上千个克隆以内,而抗体库可筛选106以上个克隆。3.抗体库技术直接得到抗体的基因,既无杂交瘤丢失之虞,又便于进一步构建各种基因工程抗体。4.抗体库技术得到的抗体可以在大肠杆菌表达,可利用原核表达系统的优势。5.一些难于制备的抗体,如针对弱免疫原、毒性抗原的抗体,以及人源抗体的制备可以得到解决。组合抗体库技术出现后不到一年,即被噬菌体抗体库技术所代替,该技术是在噬菌体表面展示(phagedisplay)技术基础上建立起来的,是迄今为止发展最成熟、应用最为广泛的抗体库技术。1985年Smith—证实噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造。1988年Parmley—将已知抗原决定簇与噬菌体PⅢN端融合呈现在其表面。1990年McCafferty—用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代。一系列噬菌体文库的构建—噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。第二节噬菌体抗体库技术一、噬菌体展示技术的原理•在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。PhageDisplayofPeptidesSelectionFromLibraryofRandomMutantsRandomLibraryofDNASequencesGene3or8+Gene3FusionsEachPhageDisplaysOnePeptideSequenceTranslatedfromDNAtoPeptideinE.coli非展示系统展示系统噬菌体展示技术最关键的优势有三：•第一：淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；•第二：所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；•第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。二、噬菌体抗体库的构建噬菌体抗体库技术(phagedisplayantibodylibrarytechniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面展示技术,把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体。构建Fab抗体库和ScFv抗体库的差别２８５页VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2FabFcMembraneExtensionAntibodyIgGstructureVHVLCLCH1CH2CH3FvFvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable免疫球蛋白基因可来源杂交瘤细胞体外免疫的细胞致敏及非致敏的B淋巴细胞(骨髓、外周血)病灶局部引流淋巴结扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等其中以淋巴结的B淋巴细胞较好单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，首先提取细胞的总RNA,经过RT-PCR扩增可变区基因酶切轻链PCR产物和表达载体二者连接，转入感受态细胞中扩增成为轻链库重链的PCR产物酶切酶切二者按照一定比例连接转化入感受态细胞加入噬菌体收集噬菌体颗粒噬菌体总抗体库表达载体噬菌体抗体库的表达载体可分为λ噬菌体(phageλ)、单链丝状噬菌体(filamentousphage)及噬菌粒(phagemid)三种系统噬菌粒是应用最多的表达载体,也是简便高效模拟B细胞产生抗体的原核表达系统。AntibodyGeneIsolationAntibodybindingspecificitiesaredefinedbythevariableregionsoftheheavy(VH)andlightchains(VL).TheDNAencodingtheVHandVLgenesareamplifiedbyPCRfromhumanBlymphocytesandarejoinedtogetherbyDNAencodingaflexiblepeptidelinker.ThiscombinatorialassemblycreatesawholerepertoireofantibodygenesencodingmanydifferentantibodyfragmentsintheformofsinglechainFvs(scFvs).Phagedisplayvector&LibraryGenerationThepopulationofantibodyscFvgenesareclonedinaphagedisplayvectortocreateafusionwiththephagecoatprotein.Inthiswayalibraryiscreatedinbacteria经典的筛选方法有两种290页一是将纯抗原包被在固相介质上,如酶标板、免疫试管或亲和层析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体。（固相筛选）二是将抗原与生物素基团相连,再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。（液相筛选）三、噬菌体抗体库技术优势（一）能模拟天然抗体库,不需要免疫人和动物在噬菌体抗体库中,含有人抗体各种基因信息的全部mRNA,为全套抗体基因的获得提供了良好材料。构建噬菌体抗体库时,抗体重链基因和轻链基因在体外的重组,造成重、轻链间的配对具有很大的随机性,一般认为,107个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的99%。因此,构建一个库容量为108的组合噬菌体抗体库,理论上认为基本上包括了所有的抗体分子。（二）适应于大规模工业化生产DNA操作是在细菌中增殖,比杂交瘤技术简单快速,制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株至少需要数月,而噬菌体抗体库技术最短只需几周的时间。（三）可获得不同亲和力的抗体在构建噬菌体抗体库时,抗体重链与轻链基因的重组,就模拟了机体内抗体亲和力的成熟过程。在噬菌体抗体库中,抗体重链与轻链间的配对存在着很大的随意性,这往往能改变B细胞中原有的抗体重、轻链间的配对方式,产生出不同亲和力的抗体。四、噬菌体抗体库的应用研制疫苗和诊断试剂有学者用乙肝病人的阳性血清中的抗体从噬菌体随机肽库中分离到乙肝病毒特异性的噬菌体模拟肽；Lundin等对HIV-1病毒也做了相应的研究,从噬菌体抗体库中分离到能够诱发针对HIV-1的免疫反应的噬菌体肽。表位研究确定核酸结合蛋白通过构建锌指的随机肽库,采用核酸作为靶分子进行筛选,可以得到其相应的结合蛋白。药物开发利用噬菌体肽库的多样性,筛选出能同受体特异结合的重组噬菌体多肽，可作为受体的激动剂或拮抗剂。基因治疗有学者将呼吸道内皮细胞暴露于随机肽库中,筛选出与之相结合的高亲和力的肽分子,分离相应基因,以重组腺病毒作为载体将外源基因导入呼吸道内皮细胞内,使外源基因得到高效表达,治疗效果明显。单克隆抗体噬菌体抗体杂交瘤技术展示技术宿主细胞:杂交瘤细菌筛选范围:~103107109时间:几个月几周操作:繁杂相对简单免疫:必须可避免人源抗体:+费用:高低生产量:有限无限基因获取:再克隆直接应用前景:有限不可估前景•噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。第三节选择性感染噬菌体展示抗体库技术选择性感染噬菌体展示(selectivelyinfectivephagedisplay)技术即SIP技术,是在噬菌体展示技术的基础上发展起来的。该技术通过将候选蛋白与配体之间的结合反应与噬菌体感染和扩增直接联系起来,不必经过亲和筛选与洗脱,直接获得特异性候选蛋白基因。一、选择性感染噬菌体展示SIP技术的原理294页将筛选配体与N1、N2复合物化学偶联作为接头，与gIII融合蛋白特异性结合，重组噬菌体恢复感染大肠杆菌的能力gIII蛋白N1结构域N2结构域CT结构域a体内SIPb体外SIP295页经过一轮SIP筛选之后,就可以捕获到紧密结合的配体结合分子；而且经过几轮筛选之后,还可以富集具有最佳结合活性和最佳折叠活性的配体结合分子。但是SIP技术本身还存在一定的缺陷。例如在进行体内SIP筛选时,由于配体接头与候选蛋白之间有可能形成伪二硫键桥,或者在特定条件下(尽管出现几率很低),由于噬菌体发生的一系列的遗传重组,恢复了N1/N2结构域与CT结构域之间的某种共价连接,从而导致非特异筛选。第四节核糖体展示抗体库技术以噬菌体展示抗体库技术和SIP抗体库技术为代表的体内筛选抗体库技术具有一些共同缺点。在构建抗体库时,由于必须经过细菌转化的步骤,抗体库的容量将受到转化效率的限制(一般不超过1010)；某些候选抗体分子的表达会抑制宿主菌(E.coli)的生长,甚至具有毒性,这样在进行亲和筛选之前,这些候选抗体分子的克隆即已经丢失；在进行噬菌体展示的亲和筛选时,具有极高亲和力(picomolar级)的抗体分子与抗原结合后,很难被洗脱下而丢失；在进行抗体分子定向进化时