抗体生产用反应器放大中的问题及对策

466中国医药生物技术2013年12月第8卷第6期ChinMedBiotechnol,December2013,Vol.8,No.6DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.06.015·调查与研究·抗体生产用反应器放大中的问题及对策段须杰由于具有靶向明确、副作用小等优势，抗体药物近年来发展迅速。2012年，抗体药物全球销售额已达650亿美元[1]。放眼国内，一方面国家通过“新药创制”科技重大专项为生物医药产业发展提供强有力的科技支撑，同时越来越多的抗体药物面临“专利悬崖”，在国内也形成了抗体药物的开发热潮。众所周知，工程细胞株构建、动物细胞大规模培养工艺开发以及抗体质量分析已成为我国抗体药物产业化的主要瓶颈[2]。其中，工程细胞株构建包括宿主细胞改造、表达载体构建与转染、高表达细胞株筛选等关键技术[3]；动物细胞大规模培养工艺开发包括培养基开发、培养工艺优化以及反应器放大等关键技术[4-5]；而抗体质量分析则包括影响药物特性（如安全性、药代动力学和药效动力学等）的所有质量表征，例如糖基化、纯度、电荷分布、生物学活性等[5]。值得一提的是，无论是细胞株构建还是培养工艺开发，都必须以满足抗体质量要求为前提。反应器放大作为大规模细胞培养的关键环节，对抗体的产量和质量影响十分显著。然而，目前国内企业的抗体开发大多处于申报阶段，尚未面临产业化问题，同时生产规模多为百升左右，因而反应器放大过程中存在的技术难题多未面临。本文将从介绍细胞培养反应器种类及放大原则入手，重点探讨近年来有关反应器放大过程中存在的问题及对策，以期对国内企业进行抗体生产工艺放大及产业化起到指导作用。1细胞培养反应器概述1.1反应器种类尽管近年来涌现出以降低剪切、增强传质混合为目的的新型反应器，如GE公司WAVE®反应器、PBSBiotech公司Air-Wheel®反应器等，但是抗体药物生产仍主要采用通气搅拌式反应器。根据反应器材质可将其分为不锈钢反应器和一次性反应器。1.1.1不锈钢反应器迄今为止，FDA批准的抗体药物基本都是在不锈钢反应器内完成生产的[1]。由于早期抗体产量较低，因此生产规模大都在10000L左右。不锈钢反应器通常涉及CIP模块、SIP模块、存储模块等，因此管路连接十分复杂，对操作人员要求较高。一旦出现污染，便需要对整个系统进行排查和灭菌。同时，不锈钢反应器还面临着高昂的前期设备投入以及运行成本。著名的反应器制造商主要包括Sartorius公司、Applikon公司、Bioengineering公司等。1.1.2一次性反应器近年来，一次性反应器凭借其免清洁、免灭菌、操作灵活等优势迅速占领国内外市场。Shire公司商品名为VPRIV®的酶制剂即采用一次性反应器进行生产，并已获得EMA批准上市。用于动物细胞培养的一次性生物反应器品牌众多，例如Sartorius公司的BIOSTAT®STR、Thermo公司的Hyclone®SUB和GE公司的Xcellerex®XDR等。与传统的不锈钢反应器相比，无论是细胞生长、抗体产量，还是抗体质量，采用一次性反应器都可以达到高度相似，同时还可以显著降低生产成本，缩短生产周期[6]。此外，Smelko等[7]通过一次性反应器（1000L）和不锈钢反应器（15000L）对比研究发现，无论采用CHO细胞还是NS0细胞培养，都能够获得质量一致的抗体产品。1.2反应器放大原则动物细胞对于培养微环境的改变非常敏感，因而在反应器放大过程中常常会遇到挑战。就生物反应器放大而言，可将反应器操作参数分为两类：体积依赖性参数和体积非依赖性参数[8]。其中，体积依赖性参数包括搅拌转速、通气量、培养体积、流加培养基体积等，而体积非依赖性参数包括温度、pH、溶氧水平等。反应器放大的基本策略是保持体积非依赖性参数不变，同时适当地放大体积依赖性参数。然而，表1动物细胞培养反应器放大原则放大原则参数经验公式氧气传质系数（KLa）KLa=C(Pg/V)α(vs)β混合时间N2=N1(d1/d2)1/4非通气条件下单位体积功率输入（P/V）P/V≈N3/d2叶尖速率N2=N1(d1/d2)搅拌相关雷诺数（NRE）N2=N1(d1/d2)2气体体积流速（VVM）Qgas通气相关表观通气速率（vs）vs=Qgas/AV尺寸相关高径比H2=H1(d2/d1)注：C、α、β：常数；Pg：通气条件下功率输入；P：非通气条件下功率输入；V：工作体积；vs：表观通气速率；N1：放大前搅拌转速；N2：放大后搅拌转速；d1：放大前桨叶直径；d2：放大后桨叶直径；N：搅拌转速；d：桨叶直径；Qgas：气体体积流速；AV：反应器横截面积。基金项目：“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09105301）作者单位：210042南京，江苏先声药业有限公司，Email：[e-mail]收稿日期：2013-09-09中国医药生物技术2013年12月第8卷第6期ChinMedBiotechnol,December2013,Vol.8,No.6467对于体积非依赖性参数而言，往往是非线性放大，因此在实际应用过程中常常采取经验性放大准则，详见表1[9-10]。如表1所示，体积非依赖性参数的放大基本可以分为三类：搅拌相关（包括氧气传质系数、混合时间、P/V、叶尖速率和雷诺数）、通气相关（气体体积流速和表观通气速率）以及几何尺寸相关。由于基于几何尺寸的放大原则仅仅考虑反应器的外形尺寸相似，而忽略了反应器内部的传质与混合，因此在实际应用中很少单独使用。对于搅拌和通气相关的参数而言，很难保证所有参数在放大过程中都保持不变，必须针对具体细胞株以及培养基的特性，寻找培养工艺中昀敏感因素，从而保证工艺放大的一致性。2反应器放大存在问题及对策搅拌和通气作为关键的体积依赖性参数，已成为细胞培养工艺放大公认的难题。一方面搅拌可以促进培养基、O2等营养物的混合，同时加强气液传质效果；另一方面，通气可以满足细胞生长和抗体合成的O2需求，还可以排除溶解于培养液中的CO2。然而，无论是搅拌还是通气都是一把“双刃剑”，过高的搅拌速度和过大的通气量所产生的剪切力又会对细胞生长产生负面影响。由此可见，细胞培养反应器放大过程中遇到的诸如剪切力、O2供给、CO2排除、pH控制等问题皆与搅拌和通气有关。2.1剪切力细胞培养反应器内剪切力按照来源大致可以分为两类：搅拌相关和通气相关[10]。本节将详细阐述由上述两类剪切力对细胞造成的损伤机制及解决办法。2.1.1搅拌相关剪切力搅拌相关的剪切力主要是指由搅拌桨运动产生的流体剪切力，该剪切力会造成细胞死亡、非致命的生理反应、抗体糖基化水平降低等影响[11-13]。根据Kolmogorov湍流理论可知，只有当细胞尺寸大于Kolmogorov湍流尺度或者与之相当时，才有可能受到流体剪切力的影响。大量试验结果表明，当反应器内平均能量耗散率达到105~106W/kg时，会造成细胞死亡；当反应器内平均能量耗散率达到1~100W/kg时，会造成细胞的非致命生理反应。而在通常情况下，细胞培养反应器的平均能量耗散率只有0.01~0.15W/kg，因此流体剪切对细胞的影响微乎其微。2.1.2通气相关剪切力根据气泡的形成周期可将其对细胞造成的损伤分为四个阶段：①气体分布器处气泡形成；②搅拌桨处气泡合并与破裂；③反应器内气泡上升；④气液交界面气泡破裂。研究结果表明，气液交界面气泡破裂是导致细胞损伤的剪切力的主要来源，而气泡的形成与上升对细胞的损伤很小[10]。Trinh等[14]通过设计一个可使大量、单个气泡在短时间内破裂的装置来证明气泡破裂对细胞造成的伤害。结果显示一个2mm的气泡破裂可以导致约1000个细胞死亡。除此以外，采用不同孔径的气体分布器以及改变分布器与搅拌桨的相对位置发现，与大气泡相比，小气泡对细胞的损伤更大[10]。2.1.3降低剪切力损伤与搅拌相关的剪切力可通过降低搅拌转速、改变搅拌桨形式（如翼型桨、象耳桨、斜叶桨等）来实现。由于改变搅拌转速或搅拌桨形式会影响反应器内部的混合效果，因此在放大过程中需要特别注意。通气相关的剪切力则采用添加剪切保护剂的方式降低气泡对细胞的损伤。PluronicF68作为一种非离子表面活性剂，可以阻止气泡与细胞之间的相互作用而避免气泡对细胞的损伤，因而常添加至培养基中。然而，Gigout等[15]发现CHO细胞对PluronicF68会产生内吞，因此在添加时需注意其浓度选择。2.2O2供给O2是细胞培养重要的营养物质，通常30%的溶氧水平即能满足大多数细胞的正常生长。对于大规模、高密度细胞培养而言，细胞对O2的消耗速率很快，往往需要通过微泡分布器来加强气液传质。微泡分布器（微米级）和大泡分布器（毫米级）是细胞培养常用的两种分布器。前者通过增加气泡的表面积来提高氧气传质系数（KLa），但会在气液交界处形成一层较厚的气泡层，进而导致培养后期大量泡沫形成。若用大泡分布器供氧则会需要较大的通气量，往往很难实现放大，因而常用来通入空气以排除CO2。Hyclone®SUB反应器便采用微泡和大泡分布器共用的方式实现工艺放大。与此同时，随着反应器体积的增加，混合时间明显增加，造成反应器内的溶氧水平呈现梯度化分布。研究结果显示，溶氧水平的改变不仅影响细胞的代谢情况，而且显著改变蛋白的糖基化水平[5]。Serrato等[16]通过溶氧水平的振荡性改变来模拟大规模培养过程中可能存在的溶氧梯度化分布。结果表明，振荡性改变溶氧水平会明显降低细胞生长速率、昀高细胞密度以及细胞活力。2.3CO2排除CO2排除是反应器放大的另一个难题。由于动物细胞的呼吸熵约为1，即细胞每消耗一分子O2便产生一分子CO2，同时培养基中CO2的溶解度远高于O2，使得反应器内的CO2短时间内会大量累积。当反应器内二氧化碳浓度达到15%~20%[（1.5~2.0）×104Pa]时，便会对细胞产生毒害作用，并且过高的二氧化碳分压也会对抗体的电荷分布和糖基化产生影响[17-19]。因此，培养基中常会添加20~40mmol/LNaHCO3作为缓冲体系。然而，当CO2分压超过1.3×104Pa时，将远高于NaHCO3的缓冲能力，必须采取其他措施将其控制在合理的范围。Mostafa和Gu[20]考察通气量、搅拌转速、气泡尺寸等多种因素对CO2排除效果的影响，发现增大深层通气量或使用大泡分布器可以显著降低CO2分压，而改变搅拌转速或增加表层通气量则对CO2分压影响很小。2.4pH控制pH作为一个重要的工艺控制参数，直接影响细胞正常生长以及抗体糖基化水平[5]。细胞培养过程中产生的乳酸和CO2会使得培养液pH迅速下降，因而需要通过补加碱液（如NaHCO3、Na2CO3等）进行pH控制。随着反应器规468中国医药生物技术2013年12月第8卷第6期ChinMedBiotechnol,December2013,Vol.8,No.6图1Scale-down模型用于生产工艺表征和生产支持模的增加，混合时间也逐渐增加，碱液的补加也会造成反应器内局部pH过高，进而导致细胞裂解[21]。因此，大规模反应器碱液补加位置的选择非常重要，同时应尽可能选择较低浓度的碱液进行pH控制。此外，Goudar等[22]研究发现，采用Na2CO3代替NaHCO3，不仅能够降低因补加碱液造成的渗透压增加，同时还可以显著降低CO2分压。2.5补料培养基流加与碱液流加相似，补料培养基的流加也应注意培养基的流加位置和浓度。补料培养基的浓度通常较高（如葡萄糖等），短时间内会造成局部营养物质“过剩”，进而对细胞的代谢状态产生影响。Takuma等[23]研究发现，葡萄糖浓度的改变会对乳酸和丙氨酸的比生成速率产生显著影响，同时，局部营养物质的“过剩”也会加剧溶氧水平的梯度化[24]。3Scale-down模型及其应用Scale-down模型是指用于抗体药物工艺开发的实验室规模的模型，通常可以放大到中试及生产规模。另外，它常作为模拟生产规模的有利工具。如图1所示，工艺开发贯穿整个抗体药物临床试