用非损伤微测技术研究肿瘤细胞的耐药性与其胞外H流变化的相关

0引言无论是正常细胞还是肿瘤细胞，细胞内pH（pHi）是细胞维持各种生理功能的重要参数。为维持pHi的稳定，细胞在产酸和泌酸之间存在着动态平衡。实体瘤的重要特点之一是细胞间质呈酸性。磁共振光谱法（magneticresonancespectroscopy，MRS）揭示，肿瘤细胞的“Warburg效应”使肿瘤细胞比正常细胞产生更多的酸，但对肿瘤细胞检测发现pHi值较正常细胞无明显区别，而细胞外pH（pHe）和细胞内酸性囊泡内的pH（pHv）明显低于正常细胞，提示可能与肿瘤细胞有较强的泌酸功能有关[1]。调节药物进入细胞的重要机制之一是细胞内外的pH梯度差[2~4]。在正常细胞中，pHe基本上是中性的，pHi是偏酸的，这使得弱碱性的药物被动进入细胞。绝大多数化疗药物均为弱碱性电解质，在体液内均有不同程度的解离。分子状态（非解离型）药物疏水而亲脂，易通过细胞膜；离子状态药物极性高，不易通过细胞膜的脂质层，这种现象称为离子俘获（iontrapping）。弱碱性的药物在酸性环境中易于离子化，因此，肿瘤细胞较低的pHe能够降低一些化疗药物的效果。其他一系列的机制亦与此相关，包括酸化降低了细胞周期中处于分裂状态的细胞数，产生了选择性的凋亡抵抗表型和由离子梯度决定的药物分布或离子俘获[5,6]。离子俘获模型预测，弱碱性化疗药物，如阿霉素、柔红霉素和长春新碱在酸性环境中将离子化并聚集在更加酸化的区室中，因此，肿瘤的酸性pHe将有效地阻断药物进入细胞或中和药物，以及将药物隔绝在酸性的细胞囊泡中以阻止到达它们细胞内的作用靶点，从而降低其对肿瘤细胞的杀伤作用[7]。研究者还观察到遗传背景相同的耐药肿瘤细胞株和药物敏感细胞株细胞内外的pH值差别及其变化对耐药性的影响：在pHe值降低时，耐药株能保持pHi的稳定，而药物敏感株pHi容易随pHe的降低而降低，提示药物敏感株调节pH的质子泵V-ATPase的活性较低，pHi易随pHe而变化，而耐药株对生物物理学报第二十四卷第三期二八年六月ACTABIOPHYSICASINICAVol.24No.3Jun.2008收稿日期:2008-03-05通讯作者：许越，电话：[phone]，传真：[phone]E-mail：[e-mail]用非损伤微测技术研究肿瘤细胞的耐药性与其胞外H+流变化的相关性宋瑾1，唐勇2，PingZhang3，许越1,4（1.美国扬格非损伤技术中心，旭月（北京）科技有限公司，北京100080；2.北京中医医院，北京110180；3.耶鲁大学医学院，细胞和分子生理学系，纽黑文市，CT06520，美国；4.马萨诸塞州立大学生物系，阿姆赫斯特市，MA01003，美国）摘要：介绍了人乳腺癌细胞（药物敏感株MCF-7/S及耐药株MCF-7/R）在化疗药物阿霉素（adriamycin，ADR）处理下，细胞外pH和H+流动方向和速率的变化。为此，建立了一种基于非损伤微测技术（non-invasivemicro-testtechnique，NMT）的药物抗性研究方法（drugresistancestudymethod，DRSM），该方法可用于研究器官/组织/细胞外离子/分子活性与肿瘤细胞耐药性之间的相互关系。结果显示存在一个持续的并以固有振荡形式出现的胞外H+流现象。此外，耐药株净H+流在加ADR前趋近于零，而敏感株净H+流呈明显内流。敏感株和耐药株加ADR后净H+均呈外流，但耐药株的净H+外流速率要高于敏感株5倍。与净H+流动速率结果相一致的是胞外的pH也产生了相应的变化。因此，实验为胞外H+活性与肿瘤耐药性的相互关联提供了直接证据。关键词：非损伤微测技术；H+浓度及流动速率；MCF-7肿瘤细胞；化疗药物耐药中图分类号：R965.22008年生物物理学报Fig.1Diagramofnon-invasivemicro-testtechniquesystem(BIO-001A).(A)Protonselectivemicro-electrodewasconnectedtoapre-amplifierwhichwasthenmountedonacomputercontrolled3Dmicro-manipulator.OnlyMCF-7/SandMCF-7/RthatattachedtothebottomofthePetridishweretested.Duringtest,3mlPBSwasaddedintothePetridishwhichwasplacedonaninvertedmicroscope.Motionofthe3Dmicro-manipulator,imageacquisitionanddatacollectionwerecoordinatedandcontrolledbyASET2.0softwarewhichisrunningonaWindowXPpersonalcomputer.(B)Howtheionicfluxesweremeasured.Briefly,thesameoneH+selectivemicro-electrodewastakingmeasurementsattwopointsinaliquidmediaenvironment.IftherewereanH+gradientasshownintheimage,therewouldbeavoltagedifferencebetweenV1andV2.ThesignofV1andV2subtractionwouldtellusthedirectiontheH+fluxwhereastheFick'slawofdiffusionJ=原D·dc/dxwouldgiveustherateofH+diffusionwithaunitofpicomoles/(cm2·s)LIXBackfillingsolutionAg/AgClH+-selectiveelectrodeV1V2J0=原D·dcdxdcdx(B)H+LightsourcePetridishMCF-7cellsH+-selectiveelectrode3DMCholderImageacquisitionsystemTheNMTsystem(Non-invasivemicro-testtechnique)YoungerUSASci.&Tech.Corp.3Dmicro-manipulatorBottom-viewmicroscope(A)pHi的稳定有较强的调节力[8]。进一步研究证明，肿瘤细胞内外的pH梯度差并未改变化疗药物的内流数量，而是改变了药物在细胞内外的分布[9]。非损伤微测技术或称无损微测技术，是一种选择性离子/分子微电极技术。非损伤微测技术以其特有的非损伤性测量方式逐渐被广泛应用到基础生物学、生理学、神经生物学、环境科学、药理学、材料科学等诸多领域。目前，非损伤微测技术不但可以测量H+、Ca2+、K+、Na+、Cl－、NO、O2、H2O2及温度等的参数，而且可以同时采集多种离子/分子参数，为获得生物样品分子或离子运动的有关信息提供了良好的实验平台[10]，其系统组成示意图及工作原理见图1。2第3期用非损伤微测技术研究肿瘤细胞的耐药性与其胞外H+流变化的相关性采用非损伤微测技术测量时，选择性微电极不接触被测材料，并在计算机控制的步进电机带动下围绕被测材料进行三维的运动测量，克服了传统的将微电极插入到细胞或组织中所带来的损伤，进而避免了由于损伤造成的测量数据不真实或出现假象的可能性。该技术可以获得测量位点的离子/分子浓度、运动方向和速率的信息，采用单一微电极测量是最常用的检测方式，但随着技术的不断发展，目前可以实现两个甚至多个微电极同时测量两种或多种离子/分子。多个微电极同时测量的优势在于能够同时分析多个参数，尤其是当这些参数存在相关性时更加有利，例如在研究植物花粉管生长过程中的O2和H+的测量[11]。同时，除了能够多种离子/分子同时测量外，非损伤微测技术与荧光离子示踪定量技术和膜片钳技术相比，它的长时间的连续测量（几小时至十几个小时）、智能化数据采集及实时记录等特点，使得实验操作方便、快捷[10~15]。基于以上特点和优势，非损伤微测技术是研究肿瘤细胞耐药性机理与胞外酸碱度改变相关性的一种较直接和近生理条件下的理想方法。本文通过实时检测阿霉素（adriamycin，ADR）敏感株及耐药株乳腺癌细胞的pHe及H+流，证明这些值与乳腺癌细胞对抗肿瘤药物阿霉素的耐药性具有一定的相关性。1材料和方法1.1细胞培养人乳腺癌细胞ADR敏感株MCF-7/S及耐药株MCF-7/R由首都医科大学附属北京中医医院中心实验室提供，ADR对MCF-7敏感细胞系的IC50（半数生长抑制浓度）为0.12262滋g/mL。ADR对MCF-7/ADR耐药细胞系的IC50（半数生长抑制浓度）为36.55036滋g/mL（来源见文献[16]）。使用高糖DMEM培养基，含10%小牛血清和双抗（青霉素100滋g/mL、链霉素100滋g/mL），置37℃、5%CO2的恒温箱中传代培养。1.2非损伤微测技术及氢离子选择性电极使用非损伤微测系统（BIO-001A，YoungerUSASci.&Tech.Corp.，USA）以静态和动态的方式选择性地测定离子浓度。选择性微电极在预先确定距离（5~30滋m）的两点间重复运动，从而测得特定离子的绝对浓度或浓度梯度，微电极的运动频率可通过编程设定在0.01~10.00Hz范围内，对于大多数微电极通常设定于0.3~0.5Hz的范围内。测定H+浓度和流速所用非损伤微电极（XY-H-01型）由旭月（北京）科技有限公司提供。H+选择性微电极前端灌充有15~25滋m选择性的氢离子的液态交换剂（LIX）（HydrogenIonophoreI-cocktailB，no.95293；Fluka，BuchsSG，Switzerland）液柱，其后灌充有10mm左右的电解液柱（40mmol/LKH2PO4和15mmol/LNaCl，pH7.0）。将电极固定器（EHB-1;WorldPrecisionInstruments）上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触。接地参比电极（DRIREF-2；WorldPrecisionInstruments）为固体电极。1.3氢离子选择性微电极的校正及氢离子活性的检测H+选择性微电极在使用前必须经过校正，只有能斯特斜率（NernstianSlope）56mv/decade的电极才可使用，校正液为pH5.5和pH6.5的PBS缓冲液。检测时将MCF-7及MCF-7/R细胞的DEME培养液换为PBS缓冲液，以dr=10滋m的移动距离，在垂直于培养皿底的方向上对细胞的H+流进行检测，利用非损伤微测系统计算机控制显微聚焦功能（详见旭月公司网站），将H+电极与细胞的距离控制在2滋m左右，将测试液更换为含10滋g/mL阿霉素（ADR）的PBS后，检测相同的细胞，对比加药前后MCF-7细胞外H+绝对浓度（即pHe）、流动方向和流动速率的变化。2结果利用非损伤微测技术能够在不接触样品的情况下实时检测进出样品离子流速、方向及离子浓度的信息，并可持续一定时间（最长可达几个小时），我们在获得乳腺癌细胞（MCF-7/S及MCF-7/R）pHe（图2B）的同时，也获得了跨膜H+流的实时动态信息（图2A）：1）耐药株和敏感株加药前后H+的内流或外流均呈现振荡的特征，且振荡幅度的变化不尽相同；2）加药前耐药株细胞外pH高于敏感株；3）加药后耐药株和敏感株H+均呈现外流，但耐药株的H+外流速率明显高于敏感株；4）加药后耐药株和敏感株的pHe也相应降低，且耐药株降低幅度明显大于敏感株。32008年生物物理学报10滋g/mLADR806040200原20原40(A)316091121152182213244Time(s)10滋g/mLADR7.607.587.567.5