实验五--凝集反应—医学免疫学实验指导

医学免疫学实验指导实验五凝集反应由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。【实验目的】1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。【实验用品】1.材料试剂：伤寒杆菌、大肠杆菌18～24小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。2.器材：洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃恒温箱（或37℃/56℃水浴箱）、显微镜。【内容和方法】一、玻片凝集试验(slideagglutination)1.原理玻片凝集试验(slideagglutination)是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。2.方法（1）取载玻片一张（平置实验台上），用特种铅笔或记号笔划分为3格，并标明1、2、3。（2）取巴氏吸管一支，套上乳胶皮头后，吸取1:10稀释的伤寒杆菌诊断血清1～2滴于第1、2格内，另取巴氏吸管一支，吸取生理盐水1～2滴于第3格内。（3）将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后取少许伤寒杆菌菌培养物与第1、3格内的诊断血清、生理盐水混合并涂抹成均匀悬液。然后用同样方法取少许大肠杆菌培养物与第2格内的的诊断血清混合并涂抹成均匀悬液。静置数分钟后观察结果。3.结果观察与判定如上述混合悬液由均匀混浊状变为澄清透明，并出现大小不等的乳白色凝集块者即为阳性（＋）；如混合物仍呈均匀混浊状则为阴性（－）。如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。本次实验结果第1格内应出现大小不等的乳白色凝集物（阳性），第2、3格内无凝集物，混合液仍呈均匀混浊状（阴性）。【注意事项】（1）伤寒杆菌为肠道致病菌，在实验中务必严格无菌操作，遵守实验规则，用后的载玻片应立即投入指定的容器中，接种环必须做灭菌处理。（2）取细菌培养物时，不宜过多，与抗血清混合涂抹时，必须将细菌涂散，涂均匀，但不宜涂得太宽，以免很快干涸而影响结果观察。二、人类ABO血型鉴定试验（玻片法）1.原理人类ABO血型抗原有A和B两种。A型红细胞膜上有A抗原，B型红细胞上有B抗原，AB型有A和B两种抗原，而O型则不含有A和B抗原。据此，如分别将抗A和抗B血清与待测红细胞混合，抗A和／或抗B血清与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，根据其凝集状况便可判定受试者的血型（见表5-1）。表5-1血型鉴定试验结果与判定2.方法（1）用酒精棉球消毒无名指指端皮肤或耳垂，待酒精干后用无菌采血针刺破表皮，用毛细吸管取血1～2滴，放入含1m1生理盐水的小试管中，混匀，即成待检红细胞悬液(约2％)。取血后，应立即用无菌干棉球压迫针眼止血。（2）取凹玻片或载玻片一张，用记号笔分为两格，并注明A、B字样。（3）用巴氏吸管吸取抗A血清、抗B血清各一滴分别滴于A、B格内（也可用2ml的一次性注射器代替巴氏吸管）。（4）另用巴氏吸管取待测5%红细胞悬液，于A格和B格内各加一滴。然后分别用牙签将抗血清与红细胞搅拌均匀(也可轻轻晃动载玻片以促其充分混匀)，以加速其反应。将玻片放置于实验台上静置数分钟后，在白色背景下观察凝集情况。3.结果观察与判定如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为澄清，并出现大小不等的红色凝集块者即为红细胞凝集；若混合液仍呈均匀混浊状，则表明红细胞未发生凝集。如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。不凝集（-）凝集（+）4.注意事项（1）试验用凹玻片或载玻片要清洁，注明A和B字佯。（2）所用抗A、抗B血清必须在有效期内(注意试剂包装说明的有效期限)使用。（3）待检红细胞悬液不宜过稀或过浓。（4）要及时观察结果，以防时间过长使标本干涸而影响结果观察和判定。三、试管凝集反应1.原理试管凝集反应是一种定量试验，常用已知颗粒性抗原来检测未知抗体及其含量。方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量已知抗原悬液，37℃过夜或56℃水浴2小时后，观察有无凝集并根据凝集程度，判定待检血清抗体的效价。本法主要用于某些传染病的辅助诊断及流行病学调查，如伤寒、副伤寒及布氏杆菌病的诊断等。2.方法（1）取洁净小试管8只并依次排列于试管架上，用特种铅笔或记号笔按顺序注明号码。（2）将1ml刻度吸管套上乳胶皮头，吸取生理盐水0.9ml加至1号试管，余下每管中分别加入0.5ml生理盐水。（3）用1ml刻度吸管取0.1ml抗伤寒杆菌“Ｈ”血清于第1管中。（4）用1ml吸管在1号管内连续吸吹三次，使血清与生理盐水充分混匀，然后吸取0.5ml加至2号试管，随后按上法进行倍比稀释直至7号试管，最后从7号管中吸出0.5ml混合液弃去。至此，1～7号试管的血清稀释度依次为1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，而8号管中只有0.5ml生理盐水，此管系阴性对照管（见图5-1）。（5）取5ml吸管吸取伤寒杆菌H菌液，加于1～8号试管中，各加0.5ml。此时，每支试管中的液体量均为1ml，1～7号试管的血清最终稀释度分别为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280。（6）持试管架轻轻振荡摇匀，以使血清与菌液混合均匀。然后置37℃恒温箱过夜或56℃水浴箱2h，再观察结果。图5—1血清等倍稀释法图示3.结果与判定（1）对照管（第8管）：上清液混浊，管底有沉淀的物，如斜置试管可见其流动，若轻轻振荡便分散呈混浊状。（2）试验管：按1-7号管依次观察。如有凝集（此为阳性），可见管底有凝集块，平铺于试管底部，边缘向上卷曲或出现凝结颗粒，轻摇即升起，“H”菌液的凝集块呈絮状，液体上部澄清。阴性者则与对照管（第8管）相同。（3）凝集强弱的判定与记录。++++：表示细菌全部凝集。试管底部有大量凝集块，上清液澄清透明。+++：表示绝大部分细菌凝集，凝集物较多或与++++相当，上清液澄清。++：表示部分(约50％)细菌发生凝集，凝集物较少，呈颗粒状，上清液基本澄清。+：凝集物很少，需仔细观察才能发现，上清液基本浑浊。-：表示不凝集。与阴性对照管相同。（4）判定凝集效价(滴度)：以凝集物明显可见，且血清稀释度又最高的那一号试管的血清最终稀释度为血清效价。4.注意事项（1）实验操作应认真仔细，如向试管内插放吸管宜轻，以免戳穿试管底；取货加样应准确；稀释血清时应仔细地逐管进行，以防跳管。（2）观察结果时，最好不要振摇试管，以免凝集物摇散振碎而影响他人观察。四、间接凝集试验1.原理本实验是将已知的可溶性抗原吸附或偶联在与免疫无关，有一定大小的颗粒性物质（载体颗粒）表面上，然后再与相应抗体混合，并在有适当电解质存在的条件下，由抗原抗体的特异性结合而发生肉眼可见的载体颗粒凝集。该实验可用于细菌、病毒、钩体、梅毒螺旋体抗体，以及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等0的检测。可用作载体的物质有红细胞（如Rh-O型血红细胞、绵羊红细胞、兔红细胞等）、聚苯乙烯乳胶颗粒，活性炭以及硅酸铝颗粒等。若所用载体为红细胞，即称间接血凝实验，如载体为乳胶颗粒，则叫间接乳胶凝集试验（见后述）。2.方法（类风湿因子测定）（1）用生理盐水将待测血清稀释1:20。（2）用巴氏吸管吸取1:20待测病人血清一滴于载玻片上，然后加一滴类风湿免疫诊断试剂。（3）持玻片轻轻晃动使之充分混匀。5分钟内出现均匀的乳白色凝集颗粒者为阳性，无凝集者为阴性。3.注意事项应在5分钟内观察结果。因放置过久可出现假阳性。五、间接乳胶凝集抑制试验1.原理将待测样品与已知抗体混合作用一定时间后，再将其与相应抗原致敏的乳胶颗粒混合。如待测样品中含有相应抗原，便可与加入的抗体结合，当再加入致敏乳胶颗粒后，就没有相应的抗体与乳胶颗粒表面的抗原结合而发生凝集，这就是乳胶凝集抑制试验（如图5-2）。所以，不发生凝集者为阳性，表明待测样品中含有相应抗原；发生凝集者为阴性，提示待测样品中无相应抗原。图5-2间接凝集抑制试验本法主要用于检测抗原。如乳胶妊娠试验，就是先将待测孕妇尿液（含有人绒毛膜促性腺激素，HCG)与已知抗HCG抗体作用，从而抑制了抗HCG与致敏乳胶颗粒表面上的HCG结合，于是乳胶凝集被抑制。2.方法（见表5-2）（1）取凹玻片一张置实验台上，用标记笔划线分为三格，并注明甲、乙、丙。（2）用巴氏吸管取生理盐水一滴加入乙格中，然后取待测孕妇尿一滴加在甲格中，另用巴氏吸管取HCG阳性孕妇尿一滴加在丙格中。（3）于甲、乙、丙格中各加入一滴兔抗HCG血清。分别用牙签将反应液充分搅拌均匀，静置30秒至1分钟。（4）于甲、乙、丙格中各加入一滴HCG致敏乳胶试剂，分别搅拌均匀。静置10分钟左右后观察结果。表5-2乳胶妊娠试验程序3.注意事项（1）所用诊断试剂必须是有效期内。用前应充分摇匀。（2）拌搅用的牙签不能共用。（3）加样不宜过多，玻片应平置，以防两格之间反应液溢流相混。（4）如肉眼观察不够清楚，可借助放大镜观察。【实验报告与思考】1.记录玻片凝集实验的材料、方法、结果（最好用文字加图示），并讨论。2.记录血型鉴定试验的材料、方法与结果。3.记录试管凝集试验的材料、方法、结果及测定效价（可用表格方式表示）。4.记录类风湿因子乳胶凝集试验的材料、方法与结果。试对结果作讨论分析。5.记录乳胶妊娠试验的材料、方法、结果及判定。试验结果予以分析讨论。6.玻片凝集试验与试管凝集试验有何区别？直接凝集试验与间接凝集试验有何不同？【BioRike博瑞克官网】