植物长链非编码RNA功能研究进展

·综述与专论·2015,31(6):1-7生物技术通报BIOTECHNOLOGYBULLETIN收稿日期：2014-06-06基金项目：国家自然科学基金项目（31200914），山西省青年科学基金项目（2012021023-4），中国博士后科学基金项目（2012M520600），山西省高等学校科技创新项目（2015145）作者简介：牛旭龙，男，硕士，研究方向：玉米功能基因组学；E-mail：[e-mail]通讯作者：邢国芳，女，博士，副教授，研究方向：功能基因组及抗逆胁迫；E-mail：[e-mail]经典的中心法则中认为基因一般的表达过程为经DNA转录生成RNA，再翻译为蛋白质，最终实现生物学功能。其中，RNA分子被认为是在这一过程中携带信息的唯一信使。但是，自克里克提出该理论以来，中心法则已经过了极大发展，RNA分子的角色也有了很大变化，研究证实在转录过程中它不仅是一个中间媒介，而且也是具有调节基因表达功能的分子。海量的基因组序列数据证实：DNA上编码蛋白质的区域（也就是通常说的基因）只占人类和其他高等动植物基因组的极小部分，在人体中仅有不到3%的序列编码蛋白质，基因组的绝大部分都不编码蛋白质和多肽［1］。此外，即使在具有较小基因组的模式植物拟南芥中，具有编码蛋白质功能的基因组序列也仅占整个基因组的50%以下［2］。在过去几十年的现代生物学研究中，人们的思路维持在一个“基因-mRNA-蛋白质-功能”的定式，从而有意无意地忽视了对基因组中非编码RNA的研究。实际上，真核生物中存在多种非编码RNA，如转运RNA（tRNAs）、核糖体RNA（rRNAs）、小核RNA（snRNAs）、小RNA（siRNAs和microRNAs）及长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRN-As）［3］。其中，lncRNA的长度一般在200-100000nt之间，占所有非编码RNA的80%以上［4］。目前，植物长链非编码RNA功能研究进展牛旭龙 冯万军 马金虎 邢国芳（山西农业大学农学院，太谷030801）摘要：长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是新近发现的基因表达调控因子，其广泛参与植物生长发育过程的调节，并可对环境胁迫作出响应。就lncRNA的产生与分类方法、植物中已报道的lncRNA及其对植物不同器官发育过程的影响、lncRNA与小RNA的关系、有关lncRNA的研究方法及目前研究中面临的问题进行了介绍。关键词：植物lncRNA；生物学功能；研究方法；miRNADOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.001ResearchProgressonBiologicalFunctionsofLongNon-codingRNAinPlantsNiuXulongFengWanjunMaJinhuXingGuofang（CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801）Abstract:Longnon-codingRNAs（lncRNAs）asnewlydiscoveredregulatorsforgeneexpression,participateinawiderangeofbiologicalprocessesinplants,andalsocouldresponsetoenvironmentalstresses.Inthisreview,wesummarizethegenerationandclassificationoflncRNAs,thediscoveredlncRNAsinplants,theireffectsonthedevelopmentprocessesofdifferentorgansinplants,aswellastherelationshipbetweenlncRNAandsmallRNA,researchmethods,andissuesinthecurrentstudiesoflncRNAs.Keywords:plantlncRNA；biologicalfunction；researchmethods；miRNA生物技术通报BiotechnologyBulletin2015,Vol.31,No.62有关小RNA的研究报道较多，部分小RNA在转录和转录后的调控功能已基本清楚，然而有关lncRNA功能的研究仍较少。另外在技术上，由于lncRNA的构成单元是核苷酸，某些RNA的改变，不足以改变它的主要功能，因此使得lncRNA很难被传统的遗传学方法所发现。近年来，随着基因组测序和基因芯片技术的发展，更多新的lncRNA的发现及其调控功能的研究已经成为目前生命科学领域的研究热点之一。因此，本文将对这一领域的最新研究进展作一综述，旨在为后人的研究提供思路与方法。1lncRNA的产生及分类类似于其他大多数RNA，lncRNA也由RNA聚合酶II转录而来。然而，最新发现了一些lncRNA却由RNA聚合酶III转录，这与tRNA和5SRNA转录过程相似［5］，另外还有一些lncRNA是经RNA聚合酶V转录产生［6］。大量的动物基因组测序结果显示，lncRNA具有典型的RNA特征，如5'端帽子结构和多聚腺苷酸尾巴等。大多数lncRNA分布在细胞核内，也有少数位于细胞质组分里［7］。lncRNA具有类型多、作用模式多和数量多的“三多”特点。因此，有关lncRNA的分类方法也有多种。根据其在基因组转录的位置lncRNA可分为3类：天然反义转录（NATs）、基因间lncRNA（lincRNA）和内含子lncRNA［8］（图1）。天然反义转录（NATs）是一组编码蛋白质或非编码蛋白质的RNAs与其他（有义）转录物具有互补序列可以调节有义链的表达［9］。NATs最早在病毒和原核生物中发现。根据来源NATs可以分为两类：顺式NATs（cis-NATs）和反式NATs（trans-NATs）［10，11］。cis-NATs由基因组相同位点的反义链转录产生，互补区在两个基因的重叠部分，重叠长且完全互补，通常以“一对一”的方式调节有义链的表达［12］。而trans-NATs则是在不同位点转录产生的正义和反义转录本，可与多个转录本部分互补，如部分trans-NATs后期加工可形成microRNA或siRNA［13］。现在已有多种方法用于NATs的鉴定，如基因表达的连续分析、cDNA序列分析、Northern杂交、链特异性RT-PCR及电子杂交和基因芯片等，并对多种生物的NATs进行了较为详细的研究。NATs在基因组中普遍存在，在植物中占7%-9%，动物中除了线虫较少，在其他动物中可达到5%-30%［14］。基因间lncRNA（lincRNA）广泛参与哺乳动物细胞免疫监视、周期调控、胚胎干细胞多能性分化等多种生物学过程［15］。利用染色质分离技术（chromatinisolationbyRNApurification，CHIRP）在全基因组内发现众多的lincRNA结合于特定的序列上，并且证实lincRNA在不同物种间具有高度的保守性，为进一步研究奠定了基础［16］。内含子lncRNA与表观遗传有密切联系，一个典型的内含子lncRNA-ANRASSF1通过招募PRC2到RASSF1A启动子上，降低RASSF1A的表达并增加细胞增殖，为描述其他内含子lncRNAs作用的位置特异性与表观遗传调节提供了依据［17］。InterveningIncRNAlincRNANaturalAntisenseTranscriptNATIntronicIncRNACBAProtein-codinggeneslincRNAgeneA：基因间非编码RNA（lincRNAs）从远离蛋白质编码基因的区域转录；B：天然反义转录（NATs）从蛋白质编码的反义链转录；C：内含子lncRNAs（以绿色显示），从蛋白质编码基因的内含子中的转录［8］（颜色标识见电子版）图1LncRNA三种类型如根据其功能差异将其分成两类：一类影响细胞发育进程，这类lncRNA通过反式作用、形成干扰RNA或直接与基因组DNA或蛋白互作调控细胞信号转导或蛋白/转录水平；第二类是通过调控转录、剪切或相邻基因的表达起作用［18］。而参照其与蛋白质编码基因的位置关系，可将它们分为正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因内lncRNA和基因间lncRNA等5类［19］。2不同植物中筛选到的lncRNA动物中的lncRNA研究主要集中在人、大鼠和线虫上，利用lncRNA沉默与定位分析（combinedknockdownandlocalizationanalysisofnoncodingRNAs，2015,31(6)3牛旭龙等：植物长链非编码RNA功能研究进展c-KLAN）、RNA免疫沉淀法（RNA-immunoprecipata-tion，RIP）、CHART（capturehybridizationofRNAtarget）和ChRIP（chromatinRNAimmunoprecipatati-on）等可对lncRNA进行功能缺失和细胞定位，通过研究lncRNA与蛋白质、DNA和RNA相互作用，探讨其功能与作用机制。与动物相比，对于植物中lncRNA的研究才刚刚开始。现在仍主要依赖全基因组cDNA文库、微阵列和RNA测序等高通量的技术对lncRNA进行全基因组范围的筛选。迄今为止，仅在少数几种植物中鉴定出lncRNA，涉及拟南芥、玉米、水稻和大豆等［20，21］。目前在植物中筛选到超过9000个lncRNAs，占总lncRNA的1%，其中部分lncRNA的生物学功能已经相对清楚，如Liu等［22］采用tillingarray技术，在拟南芥中发现了6480个基因间转录本，其中2708个lncRNAs可通过实验被检测到，一些lncRNA基因表现出较强的器官表达特异性，而其他的则与生物/非生物胁迫响应相关。与此同时，Zhang等［23］利用40个RNA-Seq数据集对水稻全基因组进行分析后，最终筛选到2063个lncRNAs，其中大部分在水稻生殖过程中表现出特异性，进一步的功能分析显示，一些lncRNA可造成生殖缺陷。除拟南芥和水稻外，Zhang还对玉米自交系B73和Mo17进行正反交实验，分析了胚乳中所有等位基因表达情况，最终找到38个在胚乳中表达的lncRNA与基因印记有关。其中，有25个来源于母本，而其余13个来自父本。另外，Boerner等［24］鉴别出了玉米全长cDNA序列中包含的潜在lncRNA，结果显示，玉米基因组的基因和基因间位点序列中广泛存在非编码RNA的模板区域，同时推测它们可能通过多种RNA介导机制来调节其他基因的表达。综上所述，植物中存在有大量lncRNA，这可能与植物在生长发育和应激反应过程中存在复杂的分子调控网络有关。3植物中lncRNA的功能3.1lncRNA影响植物生长发育在植物中，lncRNA广泛存在并参与生长发育进程的调节。研究表明，lncRNA对植物发育的影响已渗透到根系、花器官建成及花粉发育等各个方面。研究表明很多lncRNA在生物体发育的特定阶段产生，具有组织或细胞特异性［25］，在转录水平、转录后水平及表观遗传等方面调控基因的表达。春化作用是环境控制的表观遗传学开关，研究证实，冬季的低温可以沉默开花阻遏基因FLC（FLOWERINGLOCUSC）进而使植物在春季开花。原因在于长时间低温处理可诱导春化不敏感基因（VIN3）的表达，进而形成PRC2复合物，使开花阻遏基因H3K27me3处组蛋白大量被修饰，从而降低FLC基因表达水平。Swiezewski等［26］分析了拟南芥单核苷酸序列多态性，最终在基因组FLC基因所在的两条链50kb的相邻区域找到两个lncRNA并分别将其命名为COLDAIR和COOLAIR。这两个lncRNA均可