免疫酶技术

免疫酶技术基本原理•免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。•免疫酶技术(enzymeimmunoassay)：是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。实验一：ELISA方法检测人血清中IgG•酶联免疫吸附试验•enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶（AP）。常用的方法：间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。IndirectELISASandiwichELISACompetitiveELISA目的：*掌握ELISA技术*检测血清中IgG含量材料：•抗人IgG抗体（羊抗人IgG抗体）（一抗）•已知IgG含量的参考蛋白（作标准系列）•待检人血清•辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体（二抗）•包被液：PH9.60.05mol/L碳酸盐缓冲液•洗涤液：PH7.40.01mol/LPBS•底物溶液：OPD-H2O2•终止液：2mol/LH2S04•酶标反应板（一排/人）操作步骤•包被（用一抗包被）（已做）•洗涤3次(将洗液加入每孔，1min后倾去)•加样：将已知含量的参考蛋白IgG配比稀释7孔，第8、9孔加待检血清，第10孔作空白对照（100ul/孔）。100ul稀释液待测血清PBS-T20100ul标准品100ul100ul•孵育（37℃40min）•洗涤3次•加酶标记的抗人IgG抗体（即二抗）(100ul/孔)•孵育（37℃30min）•洗涤3次•显色（加底物溶液，100ul/孔。室温避光15-30min）•终止反应•检测(490nm波长下检测)•结果观察与分析：空白对照应无色；阳性孔呈棕黄色，标准系列各孔呈明显的颜色深浅梯度；绘制标准曲线。•注意事项：做配比稀释时，应从高浓度到低浓度；显色时一定避光；检测时应避免孔中有气泡。实验二APAAP法检测淋巴细胞亚群•用抗人T细胞CD的McAb与T细胞反应，用羊抗鼠IgG搭桥，其中一Fab连接抗T的McAb，另一Fab连接APAAP，再由复合物中的AP催化底物显色来判断CD分子的存在，从而确定T细胞的各亚群。实验原理•优点：*不经化学交联反应，避免了抗体和酶活性降低。*省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。*标本易于检测，保持时间长。•应用：*淋巴细胞分化抗原；*活化抗原；*MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达的检测。•目的：T细胞亚群检测•材料•APAAP试剂盒（含CD3、CD4、CD8McAb）•TBS缓冲液•Mayer苏木精复染液•纯丙酮•鼠抗人T亚群单克隆抗体（一抗）•羊抗鼠IgG（二抗）操作步骤1．分离PBMC，PBS调整PBMC浓度。（已做）2．甩片，固定，干燥，标记。（已做）3.加一抗（鼠抗人）10ul。37℃湿盒孵育，30min；PBS浸洗5min，擦片4.加二抗（羊抗鼠）10ul。37℃湿盒孵育，30min；PBS浸洗5min，擦片5.APAAP复合物10ul（鼠抗AP）.37℃湿盒孵育，30min；PBS浸洗5min，擦片6．碱性磷酸酶底物显色，37℃湿盒孵育，30min；PBS浸洗5min，擦片7．Mayer苏木精复染1min，自来水冲洗8．高倍镜下观察结果观察：•阳性细胞：细胞膜上或胞浆着色为红色•阴性细胞：细胞膜上或胞浆着色为无色•计数阳性细胞百分率（100-200个）正常值：•CD2、CD3阳性细胞：60-80%•CD4阳性细胞：35-55%•CD8阳性细胞：20-30%•CD4/CD8比值：1.5-2.0注意事项：•擦干细胞周围的水分，以防圈内所加试剂流散；•甩片前最好加入1%的BSA，起固定作用