ChIP实验流程整理

1、ChIP实验用的苗是正常光照条件下生长的四周大的苗子，取1.5克嫩苗组织，放入50ml1%甲醛溶液中，抽真空交联。2、用2.5ml2M甘氨酸溶液停止交联反应。3、水洗苗子数次，然后将苗用吸水纸吸干，液氮碾磨，然后用25ml提取缓冲液1重悬。extractionbufferI0.4Msucrose,10mMTris-HCl,pH8,10mMMgCl2,5mMb-mercaptoethanol,0.1mMphenylmethylsulfonylfluoride[PMSF],1*proteaseinhibitor;Roche),4、用神奇滤器或者是金属筛过滤，然后4000rpm,4℃离心20分钟5、用1ml提取缓冲液2，重悬沉淀物，14,000rpm，4℃离心10分钟。extractionbufferII0.25Msucrose,10mMTris-HCl,pH8,10mMMgCl2,1%TritonX-100,5mMb-mercaptoethanol,0.1mMPMSF,1*proteaseinhibitor)6、用300ul提取缓冲液3，重悬沉淀物，14,000rpm，4℃离心60分钟。extractionbufferIII1.7Msucrose,10mMTris-HCl,pH8,0.15%TritonX-100,2mMMgCl2,5mMb-mercaptoethanol,0.1mMPMSF,1*proteaseinhibitor)7、粗核提取物用200ul裂解缓冲液重悬，在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞。8、超声处理，以剪切基因组DNA，使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp则更佳。超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。超声处理的条件通常可以设置为10秒每次，共3-4次，功率为50W时设置为最大功率的30%，采用2mm超声头。9、对于经过超声处理的样品在4℃，12000-14000g离心5分钟。取上清(约0.2ml)至一2ml离心管中，置于冰浴。10、配制适量含有1mMPMSF的ChIPDilutionBuffer。加入1.8ml含有1mMPMSF的ChIPDilutionBuffer以稀释经过超声处理的样品，使最终体积为2毫升。ChIPdilutionbuffer1.1%TritonX-100,1.2mMEDTA,16.7mMTris-HCl,pH8.0,167mMNaCl11.取出20微升样品作为Input用于后续检测。其余近2ml样品加入70微升ProteinA+GAgarose/SalmonSpermDNA(其中约35微升为沉淀，35微升为液体)，在4℃缓慢转动或摆动混匀30分钟。此步骤的目的是减少ProteinA+GAgarose/SalmonSpermDNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特异性结合。12、4℃，1000g左右离心1分钟，将上清转移至一个新的2毫升离心管中。13、加入适量一抗，一抗的用量可以参考抗体的说明书。如果抗体的说明中未给出用于ChIP的稀释比例，可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例。通常一抗的用量为0.5-1微克。4℃缓慢转动或摆动混匀过夜。可以不加抗体作为阴性对照，或用无关的抗体作为阴性对照，同时可以用没有细胞样品的溶液作为空白对照。14、加入60微升ProteinA+GAgarose/SalmonSpermDNA(其中约30微升为沉淀，30微升为液体)，在4℃缓慢转动或摆动混匀60分钟，以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。15、4℃，1000g左右离心1分钟。非常小心地去除液体，切勿触及沉淀。随后依次用如下溶液对沉淀进行洗涤，每次洗涤液的用量为1ml，每次在4℃缓慢转动或摆动洗涤3-5分钟，随后4℃，1000g左右离心1分钟。非常小心地去除液体，切勿触及沉淀。a.LowSaltImmuneComplexWashBuffer洗涤一次。b.HighSaltImmuneComplexWashBuffer洗涤一次。c.LiClImmuneComplexWashBufLowsaltwash20mMTris-HCl,pH8.0150mMNaCl0.1%SDS1%TritonX-1002mMEDTAHighsaltwash20mMTris-HCl,pH8.0500mMNaCl0.1%SDS1%TritonX-1002mMEDTALiClwash0.25MLiCl1%NP-401%sodiumdeoxicholate1mMEDTA10mMTris-HCl,pH8.0TEbuffer10mMTris-HCl,pH8.01mMEDTA16、加入250微升Elutionbuffer。Vortex混匀，65℃转动或摆动继续洗脱15分钟。elutionbuffer(1%SDSand0.1MNaHCO3)17、1000g左右离心1分钟，将上清转移到一新的离心管中。沉淀中再加入250微升Elutionbuffer。Vortex混匀，65℃转动或摆动继续洗脱15分。1000g左右离心1分钟，取出上清。和上一步骤，即步骤16中获得的上清合并。共计约500微升上清。18、在500微升上清中加入20微升5MNaCl，混匀。65℃加热4小时，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。对于获得的作为Input的20微升样品，加入1微升5MNaCl，混匀，65℃加热4小时，同样用于去除蛋白和基因组DNA之间的交联。此步骤完成后可以继续进行后续步骤，也可以先-20℃冻存，第二天继续后续步骤。说明：此时的样品已经可以用于PCR，可以尝试使用1、2、5或10微升样品作为模板用于PCR检测目的基因。此时PCR的效果和可能被沉淀下来的DNA的量，以及整个PCR扩增体系是否容易扩增目的基因有关。如果发现PCR效果欠佳，可以考虑通过后续的纯化步骤，纯化并浓缩样品，然后再进行PCR检测。注意：通常情况下，推荐进行后续纯化后再进行PCR检测，而Input通常不必进行后续纯化步骤。19、在约520微升样品中加入10微升0.5MEDTA，20微升1MTrispH6.5和1微升20mg/ml蛋白酶K。混匀后45℃孵育60分钟。20、加入等体积Tris平衡苯酚，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。21、加入等体积氯仿，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。I.加入20微克glycogen或yeasttRNA，加入1/10体积的3MNaAc，pH5.2，再加入2.5倍体积无水乙醇。混匀后-70℃沉淀不少于1小时，或-20℃沉淀8小时以上。21.、4℃，12000-14000g离心10分钟，小心吸去大部分上清，切勿触及沉淀。22、加入约1ml70%乙醇洗涤沉淀。4℃，12000-14000g离心10分钟，小心吸去大部分上清，切勿接触沉淀。23、4℃，12000-14000g离心1分钟，非常小心地吸除残留液体。24、用少量TE或水重悬DNA沉淀，用于目的基因的PCR检测。用于PCR的引物最好能设计2组，可以用Input作为模板预先摸索出相应的PCR条件，并选择一组效果较好的引物用于最终的PCR检测。少数情况下，当PCR条带过弱时，可以采用nestedPCR技术，进行两轮扩增。说明：步骤G至步骤M也可以采用适当的DNA纯化试剂盒纯化DNA，例如碧云天的PCR/DNA纯化试剂盒(D0033)。