载体构建流程

经典载体构建流程I载体构建流程cDNA提取mRNA得到目的基因RTPCRPCR产物纯化酶切目的基因和载体纯化酶切产物连接转化菌落PCR挑取阳性克隆去测序测序正确的摇菌提质粒保菌导入表达宿主测试表达情况提取mRNA如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品采用连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵180℃，4h。RT由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开来的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片段克隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码的mRNA为模板。PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA为模板扩增目的基因。根据不同的目的，可有三类引物选择PCR得到目的基因刚开始摸条件时，都会先做一个梯度PCR，选出最适条件。由于此步为获取正确的目的基因，所以尽量避免PCR的突变格外重要。其中所采取的措施有：使用高保真酶、循环次数控制在300cycle左右、引物设计合理等。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR常出现的问题1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带3.什么条带都没有解决方法假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温度或做个梯度，摸一下条件。PCR产物纯化倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性，残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆失败。所以此步对整个分子克隆都至关重要，可适当用酚抽提、柱纯化，必要的话也可以胶回收。酶切目的基因和载体酶切注意事项两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。酶切常见问题纯化酶切产物通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶切产物连接所得阳性克隆。此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干扰。另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。回收前回收后酶切目的条带酶切载体带连接催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端残基的丢失。一般连接25度2小时，16或4度过夜。转化基本步骤：（1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。（2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。（3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。（4）每管中加700μlLB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。（5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。（6）将平板置于室温直至液体被吸收。（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。菌落PCR此步以适应现代分子生物学实验室批量工作的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶切分析以及测序检测。酶切检测阳性克隆将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期条带的即为阳性克隆。要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入，缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行测序。选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克隆。挑取阳性克隆去测序测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测序正确的阳性克隆才算成功构建载体。ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表达、结构、功能。不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修补。谢谢！