犆离子束诱变产生甜高粱汁酒精酵母高产菌株的研究

　　文章编号：１００７－４６２７（２００９）０２－０２６９－０５犆离子束诱变产生甜高粱汁酒精酵母高产菌株的研究严亚平１，２，王菊芳１，＃，陆　栋１，２，董喜存１，高　峰１，马　良１，李文建１（１中国科学院近代物理研究所，甘肃兰州７３００００；２中国科学院研究生院，北京１０００４９）摘　要：利用１００ＭｅＶ／ｕＣ离子束对高产酒精酵母菌株进行了辐照诱变的研究。采用红四氮唑作为筛选指示剂，得到了５株产酒能力有所提高的突变酵母菌。利用甜高粱汁的发酵结果表明，Ｔ４突变菌株的产酒精能力比原始出发菌株提高了１８．６％，且发酵液中的残糖含量也有所降低。随后对Ｔ４菌株在甜高粱汁中的最适宜发酵条件做了初步探索，结果表明：最适发酵温度和ｐＨ值分别为３０℃和４．５。通过１０ｌ发酵罐的验证试验表明：在同样发酵条件下，Ｔ４菌株的发酵率和产酒精能力都比原始出发菌株提高了１２％。关键词：重离子束；酒精酵母；甜高粱汁；发酵中图分类号：Ｑ６９１　　　文献标识码：Ａ１　引言２０世纪初，ＤｅＶｒｉｅｓ（１９０４）提出了辐射诱发突变的利用，至今己有上百年的研究历史，对微生物育种做出了重大贡献。辐射诱变的机理一般被认为是基因重组或染色体发生断裂而导致的基因突变或染色体畸变，存在不可控制性和诱变谱狭窄、诱变能力低等不足。２０世纪８０年代以来，随着Ｎ离子束注入水稻种子诱发变异的发现，揭开了离子束生物工程的研究序幕。现在的研究发现重离子束辐照具有传能线密度大、相对生物学效应高、能量沉积空间分辨好及ＤＮＡ双链切断功能等优点。如今，重离子辐照技术在国内外得到了较快的发展，并已成功地应用于植物、微生物的诱变育种［１，２］。在当今的世界能源使用格局中，石油是最主要的部分，约占全球整个能源使用配比的３７％。但是，作为一种不可再生能源，石油的储量非常有限。近年来，已经出现从可再生的资源中生产燃料酒精用于替代石油燃料的研究［３］。燃料酒精具有清洁、环保、安全、可再生的优点，已在欧美和巴西等国广泛使用。传统的酒精生产大部分都是以玉米为原料进行发酵，但由于玉米是我国重要的粮食资源，消耗大量的玉米来生产乙醇将会引发与人争粮的严重问题，我国政府已明确表示玉米酒精不是燃料酒精产业的发展方向。甜高粱以粮饲兼用、抗逆性强和生物产量高等优良特性受到世界各国关注。随着甜高粱产业的不断扩大，利用甜高粱茎秆汁液经生物发酵生产酒精正成为国内外的研究热点［４—９］。本实验就是以甜高粱汁作为发酵培养基，利用重离子束对普通产酒精酵母ＹＹ进行辐照诱变，采用红四氮唑（ＴＴＣ）为指示剂，筛选出能稳定遗传、酒精产量高的酵母突变菌株，并初步对最适宜的发酵条件做探索，最后进行中试发酵验证试验，以期所获得的实验结果能够用于指导实际生产。２　材料和方法２．１　实验菌种和培养基实验用产酒精酵母（ＹＹ）为本实验室保藏。固体培养基为ＹＥＰＤ培养基，用以活化酒精酵母菌并作为ＴＴＣ筛选下层培养基，具体成分如下（ｇ／ｌ）：葡萄糖２０，单摆胨１０，酵母粉１０，磷酸氢二钾１，硫酸镁０．５，氯化钠２．５，琼脂２０。ＴＴＣ筛选上层　第２６卷　第３期原子核物理评论Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．３　　２００９年９月ＮｕｃｌｅａｒＰｈｙｓｉｃｓＲｅｖｉｅｗＳｅｐ．，２００９　收稿日期：２００８０２１４；修改日期：２００９０５１７　　　基金项目：中国科学院“西部之光”人才培养计划资助项目（Ｏ６０６１８０ＸＢＯ）；中国科学院近代物理研究所所长基金资助项目（０７０６１２ＳＺＯ）　　　　作者简介：严亚平（１９８２－），男（汉族），陕西洛南县人，硕士研究生，从事生物物理专业研究；Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　　＃　通讯联系人：王菊芳，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]培养基（ｇ／ｌ）：ＴＴＣ０．３，葡萄糖３０，琼脂２０。发酵培养基为天然甜高粱汁，每升中加入２ｇ硫酸铵、５ｇ磷酸二氢钾和３ｇ硫酸镁。各种培养基１１５℃下饱和蒸汽灭菌２０ｍｉｎ。２．２　辐照将活化好的酒精酵母制成菌悬液装入无菌培养皿中，置于中国科学院近代物理研究所兰州重离子研究装置（ＨＩＲＦＬ）的治癌终端上，用１００ＭｅＶ／ｕ的Ｃ离子束辐照，剂量分别为６．２５，１２．５，２５，５０和１００Ｇｙ。２．３　高产酒精酵母菌的筛选将经过辐照处理的菌种样品分别取出少量，梯度稀释１０－６，用ＴＴＣ双层培养基法进行初步筛选。具体过程如下：吸取１００’ｌ稀释菌液涂布到下层平板培养基上，３０℃倒置培养４０ｈ，无菌条件下倒入１０ｍｌＴＴＣ上层培养基覆盖原有菌落，３０℃下避光保温２—３ｈ，然后根据菌落颜色的深浅判定酵母产酒精能力的大小［１０］。选择颜色较深的菌落接种到甜高粱汁培养基中培养４８ｈ，记录ＣＯ２失重情况，并对发酵液的酒精度和残糖含量进行分析，根据结果复筛出性状最为优良的菌株。酒精度的测定　取１００ｍｌ成熟发酵液，加入１００ｍｌ蒸馏水，置于电炉上蒸馏出１００ｍｌ液体，摇匀后用酒精计和温度计分别测定其酒度和温度，然后查表校正温度为２０℃时对应的酒精浓度。还原糖测定　用斐林试剂法测定甜高粱汁中的还原糖［１１］。总糖测定　样品经水解处理后用斐林试剂法测还原糖。２．４　最适发酵温度和最适发酵狆犎值的确定以筛选出的产酒精能力有明显提高的Ｔ４菌株为研究对象，测定最适发酵温度和发酵ｐＨ值。最适发酵温度的测定　取０．５ｍｌ活化好的Ｔ４菌液装入盛有２０ｍｌ甜高粱汁培养基的三角瓶中，分别置于２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８和４０℃恒温振荡培养８ｈ，之后静止培养４８ｈ，每６ｈ称重一次，记录ＣＯ２失重情况。最适发酵ｐＨ值的测定　取０．５ｍｌ活化好的Ｔ４菌液装入盛有２０ｍｌ甜高粱汁培养基的三角瓶中，分别调节其ｐＨ值为３．０，３．５，４．０，４．５，５．０，５．５和６．０，置于３０℃恒温振荡培养８ｈ，之后静止培养，记录ＣＯ２的失重情况。２．５　中试发酵实验Ｔ４菌株与出发菌株的中试实验在１０ｌ发酵罐（ＧＵＪＳ１０１００ＡＵＴＯＢＩＯ２０００型／东方生物工程设备技术公司）中进行。３　结果与分析３．１　高产酒精菌株的筛选ＴＴＣ全称为２，３，５氯化三苯基四氮唑，是一种无色显色指示剂，活菌中所含的脱氢酶可将它还原成红色的三苯基甲腊（ＴＦ），通过菌落颜色的深浅可以判断酵母菌呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低［１０］。将经过辐照的酒精酵母用ＴＴＣ双层培养基进行初筛，根据菌落显色的深浅，挑选出５株颜色较深的菌株，连同原始菌株ＹＹ一起接种到甜高粱汁培养基进行发酵复筛实验，所得到的结果如表１所示。表１　初筛出的突变菌株和原始出发菌株在甜高粱汁中的发酵培养结果菌株酒精度（％）残糖量／（ｇ／ｌ）ＣＯ２失重量／ｇ出发菌株ＹＹ８．６４．２３１０．２突变菌株Ｔ１９．４４．１８１０．７突变菌株Ｔ２８．８４．２０１０．７突变菌株Ｔ３９．０４．２１１０．８突变菌株Ｔ４１０．２４．０７１１．９突变菌株Ｔ５９．４４．１７１０．７从表１可以看出，在挑选出的５株突变菌中，Ｔ４菌株的产酒能力最强，发酵结束时，发酵液中的酒精度达到了１０．２％，比原始出发菌株的８．６％有了很大提高；同时相比其它突变菌株和出发菌株，Ｔ４菌株发酵液中的残糖量也相对较低，表明发酵比较彻底；ＣＯ２的失重量最高，说明其发酵能力比较强。综合考虑，选Ｔ４菌株进行最适宜发酵条件和中试实验。３．２　温度和狆犎值对犜４菌株产酒能力的影响研究Ｔ４菌株在甜高粱汁中的最适宜发酵条件时，将ＣＯ２失重作为衡量酒精发酵反应的程度。在·０７２·原子核物理评论第２６卷　酒精发酵的过程中，葡萄糖等被利用生成酒精，同时放出ＣＯ２。ＣＯ２失重量越高，说明生成酒精的过程越剧烈，发酵能力越就强。实验所得到的温度与ＣＯ２失重之间的关系如图１所示。图１不同温度下Ｔ４菌株发酵能力的变化由图１可以看出，发酵温度为３０℃时，ＣＯ２失重达到最大值为１２．４ｇ，此时Ｔ４酵母菌发酵能力最强。随着温度的逐渐升高，Ｔ４菌的发酵能力逐渐下降。当温度依次３２，３４，３６和３８℃时，ＣＯ２失重量分别为１２，１１．３，１０．６，和９．７ｇ；当温度达到４０℃时，由于高温对细胞的损伤效应，ＣＯ２失重量仅为８．３ｇ发酵力比最高峰值下降了３３％。当温度低于３０℃时，Ｔ４菌的发酵能力也明显下降，在２８和２６℃时，ＣＯ２失重量为９．７和９ｇ，比最高峰值分别下降了２１．８％和２７．４％。图２不同ｐＨ值条件下Ｔ４菌发酵能力的变化实验所得到的ｐＨ值与ＣＯ２失重之间的关系如图２所示。可以看出，当ｐＨ值为４．５时，ＣＯ２失重最大，为１２．７ｇ，Ｔ４菌株的发酵能力最好。ｐＨ值低于４．５时发酵能力明显下降，ｐＨ值为４．０，３．５和３．０时，Ｔ４菌株ＣＯ２失重依次为１２，１１．６和１０．８ｇ，比最高峰值分别下降了５．５％，８．７％和１５％，而当ｐＨ值高于４．５时，发酵能力虽然也呈现出下降，但趋势不如低ｐＨ值时明显。与温度对发酵能力的影响相比较，ｐＨ值对酒精发酵能力的影响不如温度的影响明显。３．３　犜４菌株和出发菌株的中试发酵验证实验由于各步化学反应的最佳反应工艺条件可能随实验规模和设备等外部条件的不同而改变，因此，在基本发酵条件确定以后，用１０ｌ发酵罐进行中试研究，将两次中试实验的结果归纳在表２中。表２　原始出发菌株犢犢和突变菌株犜４在１０犾中试发酵罐中的发酵培养结果发酵时间／ｈＴ４残糖量／（ｇ／ｌ）ＹＹ残糖量／（ｇ／ｌ）Ｔ４酒精度（％）ＹＹ酒精度（％）０１４０１４０００６５３．７６２４．８４．２１２２２．８４８７．２５．７１８１．８２９８．６６．３２４１．７８．７９．８７．５３０１．６４．５９．８７．９３６１．６２．４９．８８．６４２１．６２．４９．８８．６４８１．６２．４９．６８．６从发酵结束后发酵液中酒精度的比对可以看出，ＹＹ菌株在发酵进行到３６ｈ时，发酵液中的酒精度达到了稳定值，为８．６％，而Ｔ４菌株在发酵进行到２４ｈ时发酵液中的酒精度就达到了稳定值，为９．８％，而发酵时间却缩短近１２ｈ。表明Ｔ４菌株的发酵速度比原始出发菌株更快，酒精产率更高。另外，对Ｔ４菌又进行了两次中试实验，结果如表３所示。与第一次的结果比较可以发现，在中试发酵条件下，Ｔ４菌酒精产量可以稳定地达到９．８％（犞酒精／犞发酵液），比出发菌株ＹＹ的酒精产量８．６％提高了１４％，Ｔ４菌株发酵液中的残糖量也要比原始出发菌株发酵液的残糖量低，表明Ｔ４菌株的发酵更为彻底。通过用裴林试剂热滴定法测得发酵前总糖和发酵后残总糖，计算得到Ｔ４菌株的酒精产率最高可达理论值的９３．９％，略高于国内有关甜高粱汁酒精发酵实验在类似条件下的报道值９３％［１２］。几次中试实验相隔半年，但发酵结果却比较接近，表明筛选出的Ｔ４菌是可以稳定遗传的，·１７２·　第３期严亚平等：Ｃ离子束诱变产生甜高粱汁酒精酵母高产菌株的研究具有一定的工业应用前景。表３　犜４菌的３次中试实验结果比较Ｔ４菌中试实验酒精产量（％）残糖量／（ｇ／ｌ）发酵时间／ｈ实验日期１９．８１．６２４２００８年９月２０—２６日２１０．０１．７２４２００８年１０月９—１３日３１０．１１．４２２２００９年４月１４—１９日４　结论酒精酵母的产酒精能力、酒精耐受性、发酵时间等是生产酒精中最为关键的要素，传统的工业用菌种都是针对玉米等淀粉质底物而选育的，并不一定就很适合高糖的甜高粱。因此，选育甜高粱汁酒精发酵高产菌株对利用甜高粱茎秆汁液生产酒精具有重要意义。重离子束作为一种新型的辐射源，具有常规辐射源所没有的优势，如能量可以集中释放和生物效应高等特点［１３］，用重离子对酒精酵母进行辐射处理，有望获得酒精发酵能力更强的突变株。ＴＴＣ作为一种无色显色指示剂，可以根据菌落颜色的深浅判断酵母菌产酒精能力的高低，从而挑选出产酒能力较高的菌株［１０］，我们的实验结果表明：该方法在实际筛选工作中切实可行。将重离子辐照技术和ＴＴＣ指示剂方法结合起来，可有效地提高高产酒精酵母菌的分离选育效率。本文成功地利用这种相结合的方法筛选出了一株发酵速度和产酒精能力都有较大提高的Ｔ４突变菌株，这株菌在甜高粱汁摇瓶试验中酒精产量可以达到９．８％（犞酒精／犞发酵液），后期