第一讲_高效毛细管电泳法在药物分析中的应用(chaj)

2019/8/181现代仪器分析第一讲:高效毛细管电泳法在药物分析中的应用CollegeofPharmacy,ShanxiMedicalUniversityProf.AnjiaCHEN2019/8/182第一节仪器分析法概述(generalization)仪器分析法色谱分析法√光谱分析法√电化学分析法质谱分析法2019/8/183其他仪器分析法有：流动注射分析(FlowInjectionAnalysis,FIA)热分析(ThermalAnalysis,TA)X射线分析(X-rayAnalysis)…2019/8/184毛细管电泳(CE:CapillaryElectrophoresis)又称高效毛细管电泳(HPCE),是指离子或带电粒子以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。HPCE:以内径10~200µm的毛细管柱为分离通道，对大分子和小分子等进行高效分离和检测的有关技术的统称。第二节HPCE基本知识回顾2019/8/185一、HPCE原理电泳迁移：在高压电场下，样本中各带电离子依据其所带电荷的性质、多少及大小、形状的不同向相反方向移动。电渗迁移：电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁移动的现象。当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的硅羟基发生解离，生成的氢离子溶解在溶液中，这样就使毛细管壁带上负电荷与溶液形成双电层，在毛细管的两端加上直流电场后，带正电的溶液就会整体的向负极端移动，这就形成了电渗流。带电微粒在毛细管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。分离的原因：电泳迁移，电渗迁移2019/8/186高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了25~75µm内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万甚至数千万。2019/8/187毛细管电泳原理示意图2019/8/188二、毛细管电泳的主要模式毛细管区带电泳（CZE）毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（CIEF）毛细管电动色谱（MECC;MEEKCetc.）毛细管电色谱（CEC）毛细管等速电泳（CITP）亲和毛细管电泳（ACE）非水相毛细管电泳（NACE）2019/8/189几种常用的毛细管电泳分离模式（1）毛细管区带电泳（CapillaryZoneElectrophoresis,CZE=FSCE）是指溶质在毛细管内均一的背景电解质缓冲溶液中以不同速率迁移而形成彼此分离的溶质带的电泳模式，分离的基础是淌度的差别。CZE只能分析带有电荷的离子而不能分离中性物质，是最基本、最普遍的一种分离模式。2019/8/1810CZE中背景电解质的浓度一般高于试样，起运载电流的作用，其离子有一定的迁移率。当电流通过时，缓冲溶液中的阴、阳离子以一特定的速度分别向正极和负极移动。同时试样中的不同离子将按各自的恒定速度移动，形成背景电解质离子流动中伴随有试样离子的流动。如果试样中不同离子的迁移率差别很大，就能将不同离子分离。2019/8/1811带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；u电渗流＞u电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。2019/8/1812BufferConsiderations1.Typical[buffer]:25-200mM2.Goodbufferingcapacitywithinthedesiredrange3.MinimalUVabsorbance（低紫外吸收）4.Lowconductivityifpossible(低电导)5.Inexpensive/available(廉价/有效)2019/8/1813TypicalBufferSystems/FSCE(CZE)BUFFERUsefulpHRangePhosphate1.1-3.1Formate2.8-4.8Acetate3.8-5.8MES*(2-(N-吗啉)乙磺酸介绍)5.2-7.2Citrate(柠檬酸盐)5.4-7.4PIPES(哌嗪-N,N-二(2-乙磺酸))5.8-7.8Phosphate6.2-8.2HEPES*(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)6.6-8.6Tricine*(三(羟甲基)甲基甘氨酸)7.2-9.2Tris(三羟甲基氨基甲烷）7.3-9.3Borate(硼酸盐)8.1-10.1CAPS*(3-(环己胺)-1-丙磺酸钠)9.7-11.7*zwitterionicbuffer(两性离子缓冲液)*FromLanders,HandbookofCapillaryElectrophoresis,2ndEd.,CRCPress(1997)2019/8/1814BufferModifiers(改性剂)forCZEOrganicSolvent–Solubilizer(增溶剂),EOFmodifier(ex.methanol,acetonitrile,ethyleneglycol(乙二醇))DivalentAmine(二胺)-EOFModifier/chargemodifier(ex.Diamino-propane(丙二胺))SulfonicAcids(磺酸)-Ion-pairing(ex.HexaneSA己烷磺酸)Urea-Biomoleculedenaturant/solubilizer(生物分子变性剂/增溶剂)CationicSurfactant-EOFReversal(ex.DTAB,CTAB)(Note:highconc=micellarphase[MEKC])Cellulose(纤维素)-EOFModifier,SievingMedium(ex.methylcellulose,hydroxypropylmethylcellulose)Cyclodextrins-Solubilizerforveryhydrophobicsamples,chiral-analytediscriminator2019/8/1815毛细管电泳的几种分离模式(续)（2）胶束电动毛细管色谱（MECCorMEKC）（MicellarElectrokineticCapillaryChromatography)在缓冲溶液中加入大于临界胶束浓度(CMC)的表面活性剂。胶束相在分离中起准固定相的作用，将电泳与分配色谱相结合，既可以分离离子型化合物，也可以分离中性化合物。2019/8/1816缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。2019/8/1817电泳流和电渗流的方向相反，且u电渗流＞u电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；2019/8/1818（3）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis,CGE）在毛细管内填充多孔性凝胶或其它筛分介质，将电泳和凝胶色谱分离模式相结合，可用于生物大分子的分析，如蛋白质和DNA的分子量和碱基数的测定。毛细管电泳的几种分离模式(续)2019/8/1819凝胶具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等由于其电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难将其分离；而采用CGE能获得良好分离。它是DNA测序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分辨率极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物分子在溶液中的物理缠扰作用代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。2019/8/1820是一种根据等电点的差别分离生物大分子的电泳技术。两性物质以电中性状态存在时的pH值称为等电点，用pI表示。将被分离的物质和两性电解质混合物装入毛细管，在电场作用下，不同等电点的两性载体电解质沿毛细管自动形成pH梯度，被分离的两性物质各自迁移至其等电点，形成很窄的区带，分辨率很高。毛细管电泳的几种分离模式(续)（4）毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing,CIEF）2019/8/18211.CIEF是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质(合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物)，当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；2019/8/18224.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压(力)将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。2019/8/1823在毛细管内涂层或在凝胶在中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离目的。可用于研究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用。毛细管电泳的几种分离模式(续)（5）亲和毛细管电泳(Affinitycapillaryelectrophoresis,ACE)2019/8/1824把毛细管电泳和毛细管液相色谱结合起来的一种分离技术。在毛细管中填充或在毛细管内壁涂布、键合色谱固定相，依靠电渗流推动流动相，使中性和带有电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相之间分配平衡常数的不同和电泳速率的不同而达到彼此分离的目的。毛细管电泳的几种分离模式(续)（6）毛细管电色谱（CEC）（CapillaryElectroosmoticChromatography）2019/8/1825毛细管电色谱作为HPLC和CE的融合技术，主要有以下特点：（1）采用电渗流EOF驱动（下图），EOF的柱塞流型较HPLC的抛物线流型可以达到更高的柱效。（2）具有色谱和电泳的双重分离机理和选择性，既可分离中性分子，也可分离带电分子。（3）毛细管电色谱中没有反压问题，可以使用更小粒度的填料和更长的毛细管柱，因而具有更高的分辨能力。（4）在分离中性粒子时，毛细管电色谱不需要像胶束电动力学色谱那样使用表面活性剂，有利于和质谱方法（MS）的联用。2019/8/1826毛细管柱和电渗流示意图（5）由于毛细管电色谱中所用的毛细管柱内径小，与传统的HPLC相比，其溶剂和样品量只是后者的万分之一，这种对溶剂和样品的巨大节约，使毛细管电色谱十分经济，也更符合环保要求。2019/8/1827三、毛细管电泳的主要优点较高灵敏度(检测器相关)高分离效率高速度（一般不超过20min，有的仅需几十秒钟）所需样品量少运行成本较低应用范围广有多种模式可供选择可免于接触HPLC流动相的毒性和污染方法的开发过程简单快速2019/8/1828毛细管电泳的高分离效率HPCE:扁平型塞子流（flatflow）HPLC:抛物线状层流（laminarflow）2019/8/1829四、毛细管电泳与HPLC的比较相同之处：1.快速高效分离技术2.可定量3.全自动化4.可用不同模式5.在某些领域逐步取代HPLC/另一些领域则相互验证/互补使用。2019/8/1830四、毛细管电泳与HPLC的比较（续)不同之处:HPCEHPLC2、分离效率1、分离依据3、样品量4、检测5、制备量保留时间差异(D)）级电泳淌度差异(N