第一部分褐藻多糖硫酸酯药效实验结果

第一部分褐藻多糖硫酸酯药效实验结果褐藻多糖硫酸酯(FPS)抗血凝及降低削血液胆固醇的实验报告实验样品：FPS：中国科学院海洋研究所提供肝素标准品(1mg相当于172个单位)：中国药品物制品检定所发，批号509—8609；藻酸双酯钠片(PSS)：每片含50mg市售药品批批号930223；甘露醇烟醇酯片：每片含0.2g市售药品批号910607；实验动物：家兔：(大耳白)体重2.6～3.3kg青岛药品检验所动物室小白鼠：(昆明种)体重18～22g青岛药品检验所动物室1、抗凝血实验(一)体外实验法血浆的制备：取兔血用枸橼酸钠为抗凝剂成血浆1％的氯化钙溶液肝素标准品溶液：每1ml含2个单位的生理氯化纳溶液FPS溶液：每1ml含0.04mg生理氯化纳溶液实验：取0.8*3.8cm的玻璃管12支分成两组，每组6支，以组为肝素标准品组，另一组为FPS组，分别按表中排列次序进行实验（参照中国药典1990年版附录102页）表1肝素标准组管号试剂(ml)123456血浆0.500.500.500.500.500.50肝素标准溶液0.050.100.150.200.300.40生理氯化钠溶液0.350.300.250.200.100.00氯化钙溶液0.100.100.100.100.100.10表2褐藻多糖硫酸酯(FPS)组管号试剂（ml）123456血浆0.500.500.500.500.500.50FPS溶液0.050.100.150.200.300.40生理氯化钠溶液0.350.300.250.200.100.00氯化钙溶液0.100.100.100.100.100.10两组小管按顺序加完后，立即混匀置37℃±0.5℃水浴中，并开始计算时间观察各管凝血时间，以靠近30分钟时凝固管的较高浓度管为该次实验的终点管，并以此管计算FPS相当于肝索单位数，结果经三次实验结果的平均值为1mg的FPS相当于77.2±2.8肝素单位。(二)、体内实验1、取家兔10只，分为四组，每组5只(雌3只，雄2只)，第一组为肝素标准品组，第二组为FPS组，给药前先测定每只家兔的正常血凝时间，然后分别给予静脉注射每m1含肝素100单位的溶液2.0ml/kg和每ml含FPS1mg/ml的溶液3m1/kg，并测定注射后1、2、3、4、5、6，6个小时的血凝时间，结果肝素标准品组给药前的凝血时间为2.6±0.19分，给予静脉注射200单位/kg后，4小时内延长凝血时间均超过10分钟，5小时仍十分显著为6.0±0.71分(P0.01)，6小时恢复接近正常(P0.05)。FPS号组，给药前的凝血时间为2.5±0.22分，给予静脉注射3mg/kg后，3小时内延长凝血时间均超过10分钟，5小时时仍十分显著为4.1±0.24分(P0.01)，6小时恢复正常(P0.05)。2、小白鼠口服法：取体重18～22g小白鼠50只，分为5组，每组10只(雌雄各5只)，各组在给药前饥饿4小时后预测正常血凝时间，然后口服给药，第一组为空白对照组，给予口服水0.4m1(灌胃)，第二组为阳性对照组，给予口服每m1含10mg的藻酸双酯钠溶液0.4ml(相当于200mg/kg)，第三组为FPS高剂量组，给予口服每rnl含10mg的溶液0.4m1(相当于200mg/kg)，第四组为中剂量组，给予口服每rnl含5mg的溶液0.4ml(相当于100mg/kg)，第五组为低剂量组，给予口服每m1含2.5mg的溶液0.4m1(相当于50rng/kg)，口服给药后1.5小时、2小时和3小时分别测定其凝血时间，结果见下表3表3褐藻多糖硫酸酯(FPs)和对小白鼠（口服）血凝时间的影响（分）测血凝时间（小时）组别01.52.03.0空白对照2.40±0.122.40±0.10*2.40±0.07*2.20±0.11*FSS200mg/kg2.30±0.114.90±0.27**3.60±0.13**2.30±0.08*高剂量200mg/kg2.30±0.1110.80±0.27**8.80±0.47**5.8±0.31**中剂量100mg/kg2.2.±0.084.40±0.18**3.4±0.14**2.11±0.07*低剂量50mg/kg2.10±0.072.20±0.08*2.20±0.08*2.11±0.07*注：*P0.05**P0.01实验结果说明FPS给予小白鼠口服200mg/kg后1.5小时，延长血凝时间作用最好，到3小时时仍有非常显著的延长血凝时间的作用，中剂量l00mg/kg作用较高剂量弱，但其作用可维持2小时,50mg/kg没有显示延长血凝时间的作用。2、降低血胆固醇作用取体重22～25g小白鼠40只，分为4组，每组10只(雌雄各5只)，第一组为空白对照组，每日给予水0.5ml灌胃，第二组为阳性对照组，每日给予50mg/ml甘露醇烟酸酯混悬液0.02ml/g(相当于1000mg/kg)，第三组为FPS高剂量组，每日给予l0mg/ml的溶液0.02ml/g(相当于100mg/kg)。共实验6天，每天灌胃一次，于最后一次灌胃后1小时，分别取血测定血清总胆固醇，结果见表4。表4褐藻多糖硫酸酯(FPs)对小白鼠（口服）血凝时间的影响（分）组别动物数（只）剂量(mg/kg)血胆固醇(mg/100ml)空白对照10水0.5ml195.2±4.3甘露醇烟酸酯101000169.1±1.5**高剂量10200166.5±4.0**低剂量10100191.0±11.4*注：*P0.05**P0.01实验结果说明小白鼠口服FPS200mg/kg具有非常显著的降血总胆固醇的作用，而口服100mg/kg时则不显示作用。小结与讨论：本实验测得1mg的FPS其抗血凝作用与77.2肝素单位相当。给予家兔静脉注射3mg/kg时，其延长血凝时间的作用可维持5小时(P0.01)，给予小白鼠口服200mg/kg，其延长血凝时间的作用可维持3小时(P0.01)，口服100mg/kg，可维持2小时(P0.01)，口服50mg/kg则不显示抗凝作用(P0.05)。给予正常小白鼠口服200mg/kg具有非常显著的降血总胆固醇的作用(P0.01)。口服100mg/kg则不显示降血总胆固醇作用(P0.05)。通过上述实验结果可以说明FPS确具有较强的抗血凝和降血脂的作用。它对调整人体血脂代谢，改善高血脂症，防治粥样动脉硬化及改善心脑血液循环方面，都有明显疗效。第二部分急性毒性试验结果褐藻多糖硫酸酯(FPS)的急性毒性实验I样品来源：中国科学院海洋研究所提供FPSП实验动物：小白鼠(昆明种)体种18～22g大白鼠(Wister)体重150～170gШ实验样品的处理：取样6g加水研磨使全量成30ml的均浆(浓度为200mg/m1)备用。Ⅳ实验（一）口服法（1）小白鼠法：取小白鼠20只(雌雄各10只)，每只小白鼠按体重计算每次给予样品均浆液0.02ml/g灌胃，共给予两次(间隔4小时)总剂量为0.04ml/s(相当于8000mg/kg)，观察10天，动物均健康生存，经解剖观察内腔未发现异常。本品对小白鼠口服的最大耐受量在8000mg/kg以上，相当于临床预计用量100mg的4000倍以上。（2）大白鼠法：取大鼠20只(雌雄各10只)，每只大白鼠按体重计算每次给予样品均浆液1.5ml／100g灌胃，共给予两次(间隔4小时)总剂量为3.0ml/100g(相当于30ml/kg或6000mg/kg，)，经观察10天，动物均健康生存，经解剖观察内脏未发现异带。本品对大白鼠口服的最大耐受量在6000mg/kg以上，相当临床预计用量100mg的3000倍以上。（二）腹腔给药法实验样品的处理：取样品2g加注射用水研磨使用20ml的均浆液(100mg/ml)备用。（1）小白鼠法：取小白鼠20只(雌雄各10只)，每只小白鼠按体重计算给予腹腔注射样品均浆液0.04ml/g(相当于40ml/kg或4000mg/kg)，经观察10天，动物均健康生存，经解剖观察内脏未发现异常。本品对小白鼠腹腔注射的最大耐受量在4000mg/kg以上。（2）大白鼠法：取大白鼠20只(雌雄各10只)，每只大白鼠按体重计算给予腹腔注射样品均浆液4ml/100g(相当于40ml/kg或4000mg/kg)，经观察10天，动物均健康生存，经解剖观察内脏未发现异常。本品对大白鼠腹腔注射的最大耐受量在4000mg/kg以上。V小结：FPS对小白鼠口服的最大耐受量大于8000mg/kg，相当于临床预计用量100mg的4000倍。对大白鼠口服的最大耐受量大于6000mg/kg，相当于临床预计量100mg的3000倍。对小白鼠和大白鼠腹腔注射的最大耐受量均大于4000mg/kg。第三部分FPS对鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)（一）材料与方法（1）菌株：为组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌四株、TA39、TA98、TA100、TA102，代谢活化系统为S9，由北京市卫生防疫站提供，经生物学特性鉴定均符合要求。（2）剂量：FPS最高剂量为5000μg/mL，下推设4个剂量分别为500μg/mL、50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL，用蒸馏水作溶剂。（3）对照组：阴性对照组用蒸馏水，阳性对照组TA97、TA98用二一氨基芴20μg/mL，TA100用迭氮钠1.5μg/mL，TA102用丝裂霉素C0.5μg/mL。（4）方法：按Ames沙门氏菌诱变性试验标准方法进行，再按活化和非活化标准平板掺入法进行试验，即在加S9和不加S9不同条件下作平行测试，每个剂量做三mL，48h观察结果，计算回变菌落数(X±S)，实验重复一次。（5）评价标准：若被试样品所诱变的回复菌落数(X±S)超过自发回变数2倍者，且有剂量反应关系，并能在一个剂量上重复，有统计学意义即可判为阳性。（二）结果与讨论试验结果如表5所示，自表5可见阳性对照回变菌落数均超过自发回变的2倍以上，而FPS诱变试验的回变菌落数均未超过自发回变的2倍。因此可认为FPS对基因无致突变作用。FPS的Ames试验测试结果TA97TA98TA100TA102μg/mL－S9+S9－S9+S9－S9+S9－S9+S95000139±18.2143±14.225±2.640±5.6160±16.8196±24.6240±10.5296±18.5500127±9.6160±12.939±5.147±7.8158±12.7178±24.1180±24.5234±8.250133±5.0177±8.928±7.238±8.4153±8.3169±12.7236±18385±20.55135±11.3140±21.432±4.647±3.4125±12.7133±24.1280±17.1320±23.40.5138±12.9146±27.438±3.551±9.6111±10.8180±21.6324±38.6402±35.8自发回变40±5.0180±21.669±7.671±3.8180±7.6186±10.8315±7.2360±12.4阳性对照440±13.2510±9.8179±12.5230±14.1560±21.8621±25.61400±53.21600±48.6第四部分初步临床应用简况在经过急性毒性实验和药效实验以后，经过半年多的临床应用，已直接观察病例50例，其中高血压、高血脂症、动脉硬化(无并发症)的有40例，年龄在52～78岁之间，口服褐藻多糖硫酸酯每次100mg(胶囊型)每日三次，服药后，无不良反应，也没有胃肠道反应，无任何毒副作用，均有不同程度疗效，自感症状头痛、头晕明显减轻，食欲增加，自感有力，头脑清醒，记忆有所恢复。例1、孙XX，干部，男77岁，患尿毒病，脑动脉硬化，左房粘液瘤，冠状动脉供血不足，长期住院治疗，难以自理，服用FPS一个多月，中风预报(一)血尿素氮由11.4mmol/L，降至为6.8mmol/L，血胆固醇5.5mmol/L降至4.8mmol/L，三酸甘油酯1.35mmol/L降至0.75mmol/L，记