第三十四章抗微生物药物和敏感性试验

第三十四章抗微生物药物和敏感性试验第一节临床常用抗菌药物抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。前者是真菌、放线菌、细菌等的代谢产物，后者是经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物。一、青霉素类抗生素：包括青霉素G、耐青霉素酶青霉素、广谱青霉素等。二、头孢菌素类抗生素：包括第一代、第二代、第三代头胞菌素。三、其他β－内酰胺类抗生素（一）单环β－内酰胺类抗生素，主要有氨曲南和卡芦莫南。（二）头霉素类和氧头孢烯类抗生素，主要有头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。（三）碳青霉烯类抗生素，主要有亚胺培南、米洛培南、必安培南、帕尼培南。（四）β－内酰胺类抑制剂，主要有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。四、氨基糖苷类抗生素按其来源分为：①由链霉菌属发酵滤液提取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；②由小单胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福提霉素；③半合成氨基糖苷类，有阿米卡星、奈替米星、地贝卡星等。五、喹诺酮类抗生素第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶酸和恶喹酸。第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟沙星。第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星等。六、大环内酯类抗生素，常用的有红霉素、柱晶白霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素（一）四环素为广谱抗生素，抗菌活性的顺序为米诺环素＞多西环素＞美他环素＞地美环素。（二）氯霉素类抗生素，包括氯霉素、甲砜霉素。（三）林可酰胺类抗生素，主要有盐酸林可霉素、克林霉素。八、糖肽类抗生素，常用的有万古霉素和替卡拉宁九、磺胺类药物及增效剂分三类：①用于全身感染的药物，分为短效、中效、长效三类，有磺胺甲恶唑，磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；②肠道起作用的药物有柳氮磺胺啶银、磺胺二甲氧嘧啶；③局部应用的药物有磺胺米隆、磺胺醋酰钠。十、其他合成抗菌药（一）硝基呋喃类用于肠道、尿路感染和外用消毒，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。（二）硝基咪唑类对厌氧菌有抗菌作用，对需氧菌无效，有甲硝唑和替硝唑。第二节抗菌药物敏感性试验（AST）一、意义①可预测抗菌治疗的效果，“敏感”治疗可能有效；“耐药”肯定失败；②指导医生选择使用抗生素，AST的结果为“耐药”，即应更换药物；③提供所选择药物的依据；④监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染病流行病学，控制和预防耐药菌感染发生和流行。二、试验常规抗菌药物选择在标准中分成A、B、C、U四组,A组所列的抗生素为常规首选药敏试验药物,B组为临床使用主要抗生素,尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使用：①对A组同类抗生素耐药；②标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；③多种微生物感染；④多部位感染；⑤感染流行的控制；⑤对A组抗生素过敏、耐受或无反应。C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌（如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠球菌）。U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道外分离菌的常规药敏试验。(一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用A组一级试验并常规报告的抗微生物药,如葡萄球菌属用苯唑西林和青霉素。B组一级试验有选择报告的抗微生物药,如肠球菌属用万古霉素。C组补充试验有选择报告的抗微生物药，如葡萄球菌属用氯霉素。U组仅用于泌尿道的补充实验的抗微生物药，如葡萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。(二）苛养菌药敏试验抗生素的选用A组一级试验并常规报告的抗微生物药,如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。B组一级试验有选择报告的抗微生物药,如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松。C组补充试验有选择报告的抗微生物药，如肺炎链球菌用头孢呋辛。三、稀释法琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。结果判断将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度（磺胺可见少许散在细菌生长）。试验菌的结果报告可用MIC（μg/ml）或用敏感（S）、中介（I）和耐药（R）报告。四、纸片琼脂扩散法（一）试验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。(二)培养基和抗菌药物纸片1．抗菌药物纸片选择直径为6．35mm，吸水量为20μl的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定所示。含药纸片密封贮存2℃－8℃且不超过1周。2．培养基水解酪蛋白（MH）培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，4℃保存。（三）细菌接种用0．5麦氏比浊标准的菌液浓度，在琼脂表面均匀涂片,在15min内接种完毕。将含药纸片紧贴于琼脂表面,35℃孵育18h后阅读结果。（四）结果判断和报告用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据NCCLS标准，作出“敏感”,“耐药”和“中介”的判断。五、E试验（一）原理E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。（二）细菌接种和加样使用厚度为4mmMH琼脂平板，用0．5麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条MIC刻度面朝上浓度最大处靠平板边缘。（三）结果判断和报告读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。与NCCLS的稀释法MIC参考值高度相关。六、药物敏感试验结果解释“敏感”即表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制；“耐药”即表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。“中介”者提示该细菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。七、联合药物敏感试验和杀菌试验（一）意义目的在于：①治疗混合性感染；②预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；③联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量；④联合用药比单一用药时效果更好。出现4种结果：①无关作用小，两种药物联合作用的活性等于其单独活性；②桔抗作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；③累加作用，两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和；④协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。协同作用发生原理①联合用药的抗菌药物在不同部位抑制细菌细胞壁合成或封闭细菌的新陈代谢；②β－内酰胺类抗生素增加了氨基糖苷类药物进入细菌细胞；③联合用药的抗菌物之一是抑制β－内酰胺酶活性的药物。联合用药时，必须做联合抗菌药物敏感性试验。（二）联合抑菌试验棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MIC。药物最高浓度为MIC的2倍，对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。接种菌量为5×105CUF／ml，35℃孵育18h后观察结果。计算部分抑菌浓度（FIC）指数。FIC指数0．5为协同作用；0．5－1为相加作用；1～2为无关作用；＞2为拮抗作用。（三）最低杀菌浓度测定MBC是指能杀灭99．9％以上测试菌量的最低药物浓度，常规测试的方法包括培养基、药物稀释、细菌悬液接种等，与MIC测定法相同。八、监控抗生素的治疗效果试验（一）血清抗菌药物浓度测定血清抗菌药物浓度和抗菌药物疗效密切相关，为保证感染组织中有效浓度，血药浓度应该达到致病细菌MIC2倍以上。但某些抗生素治疗浓度和中毒浓度相近，过高的血药浓度引起毒性反应，因而监测血清抗菌药物浓度十分重要。微生物测定法与琼脂扩散法原理相似。用已知含药浓度的纸片加到混有一定指示菌悬液浓度的倾注平板表面，35℃孵育16－20h，量取抑菌圈直径。以抑菌圈直径为横坐标，含药浓度为纵坐标，画出标准曲线。然后在标准曲线找出体液测试的抑菌圈直径相应的含药浓度。（二）血清抗菌活性测定体内抗菌药物活力的测定方法即为抑菌力和杀菌力测定，称为血清杀菌活力试验。本法是取感染患者血液分离的血清对感染部位分离确证的病原菌的抑菌和杀菌能力，为供临床现用抗菌药的疗效考核评价以及感染预后的判断提供实验依据。采用体外抑菌试验和体外杀菌试验。无肉眼可见菌生长的血清最高稀释管代表患者血清的抑菌力，其菌落计数等于或小于0.1％最初接种菌量的血清最高稀释管代表患者血清杀菌力。血清抑菌力／杀菌力＞1：8常提示治疗方案有效。九、自动化仪器检测Viter－ATB系统和Microscan是半自动或全自动细菌鉴定和药敏系统，通过系统中药敏专家系统可报告分离菌的药敏结果。第三节细菌耐药性和产生机制一、细菌的耐药性对某种抗菌药物敏感细菌变成对该药物耐受称细菌耐药性。它可分为天然耐药和获得性耐药，前者是通过染色体DNA突变而致，后者往往是由质粒。噬菌体及其他遗传物质携带外来DNA片段导致产生的耐药性。突变可由细菌自发产生或在X线等物理因素或化学物质诱导产生，一般只对一种或两种相似药物耐药，在细菌耐药性上不占主要地位。接合型质粒通过接合方式，非接合型质粒通过转化。转导、转换形式产生耐药。二、细菌耐药性的生物化学机制1.产生β－内酰胺酶，水解药物β－内酰胺环而失去抗菌活性。2.产生钝化酶使抗生素失活，钝化酶有三类：①氨基糖着类钝化酶；②氯霉素乙酸转移酶；③红霉素酶和其他灭活酶。3.青霉素结合蛋自改变导致对抗生素的亲和力下降。4.药物作用靶位的改变使抗生素不易结合产生耐药性。5.抗菌药物渗透障碍，如外膜蛋白减少和药物外排作用等。6.代谢途径的改变。第四节细菌耐药性检查方法一、细菌耐药性表型检测某些特殊菌耐药表型检测的方法：（一）琼脂筛选试验以单一药物单一浓度检测耐药性称耐药筛选试验，临床上常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌，对庆大霉素或链霉素高水平耐药的肠球菌。在含一定浓度测试药物的特殊培养上，点种0．5麦氏比浊度直接菌落配制细菌悬液，35℃孵育24h后观察平板上是否有菌落生长识要有1个菌落生长，均视为耐药。（二）折点敏感试验仅用特定抗生素浓度（敏感、中介或耐药折点MIC）而不使用测定MIC时所用系列对倍抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性称折点敏感试验。当选择区分中介和耐药折点值药物浓度时，若两种抗药物浓度培养基均生长可判断为耐药；如在两种药物浓度均不生长则为敏感；仅在较低药物浓度培养基中生长提示为中介。（三）双相纸片试验挑取在血平板上菌落，稀释成0．5麦氏浓度菌液。均匀涂布于MH平板。中央贴上阿莫西林/克拉维酸纸片，在距该纸片25mm处分别贴头孢噻肟或头孢曲松、头孢他啶和氨曲南等药敏纸片作为指示剂，35℃孵育18h观察结果。若指示剂在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象（协同现象），则说明待检菌产生超广谱β－内酰胺酶。（四）自动化仪器自动化仪器Microscan有测定抗菌药物抑菌的MIC值功能。原理是先测定细菌对抗生素的MIC值，当头孢他啶与头孢他啶十克拉维酸的MIC比值或头孢噻肟与头孢噻肟十克拉维酸的MIC比值大于或等于8（即3个对倍稀释度）即判定为此细菌产生ESBL。二、β－内酰胺酶检测1.头孢哨噻吩滤纸片法用接种环挑取受试菌于商品化头孢哨噻吩滤纸片上，于10分钟内由黄色转变为红色即阳性结果，示产色头孢菌素的β－内酰胺环被酶打开。2.碘淀粉测定法用接种环挑取受试菌混于青霉素溶液中，室温下振摇30分钟。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液变蓝，继续振摇。若检测菌产生酶，则可水解青霉素β－内酰胺环变为青霉素噻唑酸，后者与碘结合，使碘淀粉复合物转变为无色，10分钟之内蓝色消失者为产酶株。三、耐药基因检测（一）