第三章中药药物分析方法ppt-长春中医药大学

第三章中药药物分析方法药物分析教研室控制中药质量，对保证中医临床用药安全、合理、有效、可靠极为重要。而中药中有效成分含量的多少与其质量优劣有直接关系，另一方面，含有毒剧成分的中药，只有严格控制其毒剧成分的含量，才能确保临床用药的安全和有效。因此，中药成分的定量分析是中药质量标准研究的核心部分，亦是质量控制中最能有效考察中药材内在质量的项目，同时也是中药稳定性考察的依据。方法学考察提取条件的考察测定方法与条件的选择定量分析方法验证第一节中药药物分析方法学验证定量分析方法验证内容包括准确度、精密度线性与范围专属性、检测限、定量限耐用性第二节化学分析法重量分析法：挥发法、萃取法和沉淀法酸碱滴定法滴定分析法沉淀滴定法配位滴定法氧化还原滴定法重量分析法标准溶液化学计量关系指示剂被测物质标准溶液待测溶液滴定分析法第三节紫外-可见分光光度法的应用一、原理Lambert-Beer定律：当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比，即k为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。当浓度以g/L表示时，称k为吸光系数，以a表示，即当浓度以mol/L表示时，称k为摩尔吸光系数，以表示，即比a更常用。越大，表示方法的灵敏度越高。与波长有关，因此，常以表示。kbcAabcAbcA二、定量分析1.单组份定量分析法的应用（1）吸收系数法根据Beer定律A=εcl，若l和吸光系数ε或已知，即可根据测得的A求出被测物的浓度。clAC%11cmE（2）工作曲线法从标准品吸光度-浓度曲线求得样品溶液的浓度。KCAKCA或（3）对照品对照法C样=C标A样/A标；C标A样/（A标C样）=样品%C样和C标分别为样品浓度和标准品浓度C样为样品标示浓度。（四）示例例：B12样品25.0mg用水溶成1000ml后，盛于1cm洗手池，在361nm处测得吸光度A为0.507，则：%00.982072028%100((%)8.2020025.0507.0%1cm1%1cm112%11标样）（）样品EEBClAEcm2.解方程组法由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。设试样中有两组份X和Y，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：图a)：X,Y组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。图b)和c)：X,Y相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和Y的浓度：其中，X,Y组份在波长1和2处的摩尔吸光系数可由已知浓度的X,Y纯溶液测得。解上述方程组可求得cx及cy。yyxxyxyyxxyxlclcAlclcA2221113.双波长法当混合物的吸收曲线重迭时，如右下图所示，可利用双波长法来测定。具体做法：将a视为干扰组份，现要测定b组份。a)分别绘制各自的吸收曲线；b)画一平行于横轴的直线分别交于a组份曲线上两点，并与b组分相交；c)以交于a上一点所对应的波长1为参比波长，另一点对应的为测量波长2，并对混合液进行测量，得到：A1=A1a+A1b+A1sA2=A2a+A2b+A2s若两波长处的背景吸收相同，即A1s=A2s二式相减，得，A=(A2a-A1a)+(A2b-A1b)由于a组份在两波长处的吸光度相等，因此，A=(A2b-A1b)=(2b-1b)lcb从中可求出cb同理，可求出ca.4.导数光谱法（1）导数光谱的特点零阶光谱的λmax处，对应于奇阶导数光谱（n=1、3、5……）的零点和偶阶导数（n=2、4……）的极值点（峰或谷），零阶导数的拐点波长，对应于奇阶导数光谱的极值点和偶阶导数光谱的零点。导数光谱的极值数=n+1个，即随着导数阶次的增加，极值数增加，谱带变窄，变锐，分辨率提高，使重叠的谱带被分离，谱带的精细结构更明显、更突出，有利于物质的鉴别。（1）导数光谱及其特征4、导数光谱法通常的吸收光谱，其吸收度是波长的函数A=C·E=C·ƒ（λ）。对波长求导，将其微分数（dnA/dλn～λ）对波长扫描可得导数光谱图。特征：A.导数光谱的阶数愈高，峰形愈尖锐且数量亦增多。B.在零阶光谱的极大处，其相应的奇阶光谱通过零点。在零阶光谱的两拐点处，奇阶导数光谱为极大或极小。C.偶阶导数光谱的形状与零阶光谱类似，零阶光谱的峰值对应于偶阶导数光谱的值，零阶光谱的拐点在偶阶导数光谱中通过零点。D.导数光谱谱带的极值数等于导数阶数加1。高斯曲线及其一至四阶导数曲线（2）定量依据若某吸收服从Lambert-beer定律，A=ECL则根据导数光谱的定义有：（n=1、2、3……）式中L为光积长度，对于给定物质在一定波长处为定值，令导数值为D，则由此可见，在一定波长处，导数值D与被测组分浓度C成线性关系，这是该法的定量依据。CLdEddAdnnnnnndEdkCCLdEddAdDnnnn（三）被测组分定量信息①零阶光谱的绘制。在同一坐标中绘制被测组分l，常用被测组分对照品溶液和干扰组分的吸收曲线，得零阶光谱曲线。②微分阶数（n）n越大，分辨越高，但信噪比降低，通常不超过4阶，一般由干扰组分吸收曲线形状而定。③导数光谱绘制选择适当的波长间隔(△λ)绘制，为好。△λ愈大，△A亦增大，测定灵敏度增大，但分解降低，通常选样1～2nm。④测定方法常用工作曲线法，可根据实际情况选择DhDp或Do作为信号参数。（4）应用与示例清宫冲剂中胆酸的二阶导数光谱测定法（i）干扰情况的考察胆酸对照液与样品的二阶导数光谱显示，在397nm，386nm波长处有相应的吸收峰和吸收谷。阴性样品二阶导数光谱呈近乎平直线条，见下左图。猪去氧胆酸的二阶导数光谱将360～420nm区间的吸收消除为二次无关吸收，不干扰样品中胆酸的含量测定如下中图。下右图表明，胆酸二阶导数光谱，其峰-谷振幅值D与浓度具有良好的线性关系，因此，可用397nm，386nm两波长的振幅D为定量参数，用峰-谷法进行测定。样品，胆酸对照品溶胆酸、猪去氧胆酸二对照品溶液液二阶导数光谱阶导数光谱二阶导数光谱A．样品1．胆酸B.胆酸对照品C.阴性样品2．猪去氧胆酸(ⅱ)测定条件：零阶光谱扫描波长：190～550nm；二阶导数光谱扫描波长，360～420nm；Δλ=5nm。(ⅲ)标准曲线：精密称定胆酸对照品约30mg，置100ml量瓶中，加入60％醋酸稀释至刻度，分别精密吸取0.1、0.2…1.0ml于15ml具塞刻度试管中，加60％醋酸至1.0ml，加入稀硫酸14．0ml，摇匀，70℃水浴中放置20分钟，取出静置20分钟后，用1.0ml60％醋酸加14.0ml上述稀硫酸作空白，测二阶导数光谱。中间波长397nm，386nm，测出各峰-谷振幅值D，得回归方程：D=57.3066C–0.1547(r=1.000)(ⅳ)样品测定精密称取约2.5g样品粉末加50ml氯仿回流提取4小时，常压回收氯仿至干，用60％醋酸溶解，定容于10ml量瓶中，精密吸取1.0ml样品液于15ml具塞刻度试管中，按标准曲线项下操作，测峰-谷振幅值D，按回归方程计算样品中胆酸含量。本法平均回收率：102.9％，RSD＝0.6％。5、差示光谱法（1）基本原理差示光谱法的关键有二，其一，提供一个近似理想的参比溶液。其二，使待测组分发生特征光谱变化，而赋形剂或其他共有组分却不引起光谱变化，因而可消除它们的干扰。设Ax、Ay分别代表两种不同介质中待测组分在测定波长处的吸收度，Az代表背景和干扰组分的吸收度，其不受测定介质改变的影响。根据吸收度加和性原理，则ΔA=A样-A参=(Ax+Az)-(Ay+Az)=Ax-Ay=(εx-εy)CL差示光谱中的振幅，即最大吸收与最小吸收之差值，也可进行定量测定，这可提高本法的专属性。（2）应用与示例差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量1）测定原理胆红素具有高度共轭体系结构，在波长453nm处为最大吸收，在可见光照射下胆红素易氧化成蓝色产物，在453nm处吸收度显著降低。2）选用日光下照射30分钟或在红外灯下照射4小时测ΔA值。3）精密称取胆红素2mg于50ml棕色量瓶中，加入适量冷(10℃以下)的酸性氯仿(150ml氯仿中含0.05ml浓盐酸)，于冰水浴中超声振荡20分钟，稀释至刻度，制成储备液。准确吸取0，4、0．8、1，2、1.6、2.0ml储备液于10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，测其光照前后在453nm处的吸收度。回归方程胆红素在酸性氯仿溶液中的吸收光谱为ΔA=0.0804C+0.00570(r=0.9995)。a．光照前b．光照后除光照反应外，其余操作均需避光。4）分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对照液，在453nm处测得各自光照前后的A值，计算ΔA。实验表明三种成药ΔA值为零或几乎为零。说明其他干扰组分在以上光照条件下不干扰胆红素的测定。5）精密称取六应丸、六神丸各60mg，牛黄消炎丸120mg置10ml带塞的试管中，准确加入冷酸性氯仿10ml，冰水浴中振荡20分钟，过滤，弃去初滤液，测续滤液光照前后的A值，算出ΔA值。由回归方程算得样品的含量。本法加样回收率：六应丸为98.8％，RSD=1.8％；六神丸为100.7％，RSD=2.2％；牛黄消炎丸为93.0％，RSD＝1.1％。６、紫外光谱法中对仪器和试剂的要求（1）仪器的校正和检定：包括波长精度、吸收度的准确性、杂散光等。（2）对溶剂的要求：用1cm石英池盛装溶剂，以空气为空白，测定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度在220nm—240nm范围内不得超过0.40；在241nm—250nm范围内不得超过0.20；在251nm—300nm的范围内不得超过0.10；300以上不得超过0.05。紫外分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器信号处理及显示第四节荧光分析法1、分子荧光的产生当处于基态单线态的分子吸收了一定频率的紫外可见光后，可以跃迁到激发单线态的各个不同能级，然后经过振动弛豫到达第一激发态的最低振动能级，如果以发射光量子的方式，跃迁回到基态各个不同振动能级，即产生荧光。2、分子结构与荧光的关系及其影响因素荧光与分子结构的关系分子荧光的产生必须同时具备2个条件：物质分子必须具有能吸收一定频率紫外－可见光的特定结构和有较高的荧光量子效率影响因素温度、溶剂的粘度、极性和溶液的PH值、荧光猝灭剂、散射光的干扰。3、荧光光谱及其特点（1）荧光激发光谱和发射光谱激发光谱测定样品对每一波长的激发光所发射的荧光强度，以激发光波长为横座标，荧光强度为纵座标作图，得荧光物质的激发光谱。发射光谱从激发光谱上可找到发生荧光最强时的激发光波长，以此进行激发，将物质发射的荧光通过单色器分光，测定每一个波长的荧光强度，以荧光强度对荧光波长作图，得荧光光谱。（2）荧光光谱的特点荧光光谱与其激发光谱具有镜像特点。一般荧光的波长比激发光波长要长些。4、定量分析方法（1）标准曲线法以荧光强度F对标准溶液浓度C作工作曲线（或回归方程）。在相同条件下测定试验样溶液的荧光强度，由工作曲线（或回归方程）求出试样中荧光物质的含量。（2）比例法取已知量的对照品，配成标准溶液（Cs），测定其荧光强度（Fs），然后在相同条件下测定试样溶液的荧光强度（Fx），按比例关系计算试样中荧光物质的含量。常用空白校正。5、荧光分光光度计（1）仪器的结构激发光原、样品池、检测器、滤光片或单色器。（2）仪器的类型目视荧光计、光电荧光计和荧光分光光度计二、荧光分析仪器6、应用与示例直接荧光法：中药成分中有的本身具有荧光特征，可经提取分离后，用直接法测定。化学诱导荧光法：利用氧化还原、水解、缩合、配合、光化学反应等化学方法，使一些自身不能产生荧光的物质转变为荧光化合物，从而用荧光法测定。制备荧光衍生物：对于无荧光或荧光较弱的物质可选择适当的荧光试剂与其生成具有特异荧光的衍生物，再进行测定。荧光猝灭法：利用某些物质可以使荧光物质的荧光猝灭的性质，间接地测定其含量。第五节原子吸收分光光度法1、原子的吸收与发射原子是由带正电荷的原子核和带负电荷的电子所组成