第二章基因工程制药新版4

第三节基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例五、宿主细胞的选择和基因导入操作体外重组的DNA分子，如果不引入到宿主细胞，则无法显示其生命力，而只是表现出纯粹的试剂性质。随着时间的推移而逐渐失活。（一）宿主细胞的选择（二）具体的转移技术（三）大肠杆菌中的基因导入和表达（四）酵母菌中的基因导入和表达（五）动物细胞中的基因导入和表达（一）宿主细胞的选择1、宿主细胞应满足的条件2、宿主细胞的类型1、宿主细胞应满足的条件（1）容易获得较高浓度的细胞。（2）能够利用廉价原料进行生产。（3）不致病。（4）不产生内毒素。（5）发热量低。（6）需氧低。（7）具有一定的细胞形态。（8）需有适当的发酵浓度。（9）容易进行代谢调控。（10）容易进行DNA重组技术操作。（11）产物的产量稳定、产率高。（12）产物容易提取和纯化。2、宿主细胞的类型原核细胞类：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。真核细胞类：酵母菌、丝状真菌、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。（1）大肠杆菌（2）枯草芽孢杆菌（3）链霉菌（4）酵母菌（5）丝状真菌（6）动物细胞（1）大肠杆菌优点：（1）生长迅速、大规模发酵经济。（2）分子遗传结构清楚、操作简单。（3）基因工程研究中采用最多的表达体系。缺点：（1）表达产物多为胞内物质，提取时需破碎细胞。（2）细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出来，形成杂质。给提取带来困难。（3）所表达的真核蛋白质在其体内常形成包含体，在提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。（4）大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统，不能对蛋白产物进行糖基化及磷酸化等修饰。（5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白造成破坏。（6）大肠杆菌会产生内毒素，难去除。至2004年，FDA共批准了大肠杆菌表达的基因重组生物技术药物18种：重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。（2）枯草芽孢杆菌优点：（1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中。（2）不会形成包含体。缺点：（1）不能使蛋白质产物糖基化。（2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌系统，常常对蛋白质产物造成破坏。（3）链霉菌优点：（1）不致病，（2）使用安全，（3）分泌能力强，（4）可将培养产物直接分泌到培养液中，（5）具有糖基化能力近年来，作为外源基因表达体系，正日益受到人们的重视。（4）酵母菌酿酒酵母研究最为透彻。干扰素和乙肝表面抗原基因在酵母菌中进行克隆和表达。优点：（1）是研究基因表达调控最有效的单细胞真核生物，（2）其基因组小、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行大规模培养，（3）无毒性，（4）基因工程操作简单，（5）表达的蛋白质产物能够直接分泌出细胞外，（6）能够对蛋白质产物进行糖基化，（7）真核基因在酵母中表达良好。至2004年，FDA共批准了酵母表达的基因重组生物技术药物8种：胰高血糖素、巨细胞集落刺激因子、乙肝疫苗、胰岛素（Novolin）、水蛭素等。虽然酵母表达系统表达的蛋白质有糖基化修饰，但是糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远，对于那些糖链极大影响生物活性的蛋白质，如EPO、治疗性抗体等，仍不能用酵母表达系统表达。（5）丝状真菌曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了成熟的发酵和后处理工艺。优点：（1）有很强的蛋白质分泌能力，（2）能正确地进行翻译后的加工，如进行糖基化、肽剪切。（6）动物细胞优点：（1）表达产物可以分泌到培养液中，（2）培养液成份完全由人所控制，（3）所分泌的基因产物接近于天然产物，（4）产物容易得到提纯。缺点：（1）生产慢、（2）生产率低、（3）培养条件苛刻、费用高，（4）培养液浓度较稀。至2004年，FDA共批准了哺乳动物细胞表达的基因重组生物技术药物53种，其中激素类5种，酶7种，细胞因子7种，凝血因子5种，治疗性抗体17种。表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌主要基因工程表达体系比较（二）具体的转移技术1、转化作用2、转导作用1、转化作用（1）基本概念（2）转化作用的特性（3）感受态细胞（4）人工感受态细胞（5）转化程序（6）影响转化的因素（1）基本概念转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.（2）转化作用的特性（1）是自然界经常发生的现象之一。（2）转化作用的前提条件是宿主细胞必须转变为感受态细胞。（3）转化作用的先决条件是要获得携带目的基因的重组DNA分子。（3）感受态细胞感受态(competent):指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色体中的一部分,导致受体细胞某些遗传性状的改变。（4）人工感受态细胞在基因工程中，宿主细胞经过人工处理，最后成为感受态细胞，称为人工感受态细胞。所有生物细胞均可处理成人工感受态细胞。制备人工感受态细胞的方法：（1）将对数生长期细胞于低温、低渗的CaCl2溶液中处理，就可成为感受态细胞。（2）用MgCl2、CsCl、LiCl、或者是多价阳离子DETE-Sephadex处理，改变细胞膜结构，也能成为感受态细胞。[5]转化程序大肠杆菌E.coli培养至对数生长期↓取20ml，悬浮于0.1MCaCl2↓离心，收集沉淀的原生质球。↓再悬浮于0.1MCaCl2↓加入2-3ug重组的DNA，混匀↓0℃放置30min↓42℃，90s↓冰浴5min↓离心，收集沉淀的细胞↓将细胞涂于选择性培养基上，进行培养↓根据菌落特性，筛选出基因工程菌（6）影响转化的因素重组DNA转化率很低，在0.1%左右。影响因素：（1）宿主的限制酶对外源性重组DNA的限制作用，会大大降低转化率，（2）宿主细胞的人工感受态形成率，会影响转化率，（3）重组DNA的构型与转化率有一定的关系，环状DNA的转化率要比线性DNA高出10-100倍，（4）外源基因与宿主DNA和同源性越高，其转化率也越高。（5）重组DNA的浓度越高、其转化率也越高，DNA的纯度越高、其转化率也越高。转化过程总结示意图2、转导作用（1）基本概念（2）转导条件（3）转导程序（4）转导作用分类（1）基本概念自然界中，通过噬菌体或者病毒的感染作用，将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程，称为转导（transduction）。感受态细胞吸收以噬菌体、病毒为载体的重组DNA的过程称为转染(transfection)。也属于转导作用。自然界许多温和噬菌体都具有转导功能。（2）转导条件体外重组的DNA，要通过转导途径进入宿主细胞，必须经过蛋白质包装的环节，DNA+噬菌体头部蛋白+噬菌体尾部蛋白→形成完整的噬菌体颗粒，才具有感染能力。（3）转导程序[A]、蛋白质体外包装程序[B]、转导程序[A]、蛋白质体外包装程序蛋白质的体外包装是通过互补作用实现的。λ噬菌体的D基因、E基因是表达蛋白质的主要基因。（1）D基因所表达的蛋白质占20%、D基因突变，在宿主体内产生大量头部蛋白。（2）E基因所表达的蛋白质占78%、E基因突变，在宿主体内产生大量头尾蛋白。[B]、转导程序用于制备包装蛋白质的宿主细胞------cI857大肠杆菌E.coli、BHB2690、BHB2688。↓D基因突变型宿主BHB2690培养、并且进行溶菌处理，提取DNA-d++外源性目的基因DNA++E基因突变型宿主BHB2688培养、并且进行溶菌处理，提取DNA-e↓温育,包装成完整的外源基因-λ噬菌体重组颗粒。（具有再感染能力）↓去感染大肠杆菌E.coli↓完成转导（4）转导作用分类（1）限制性转导作用----由温和的噬菌体或者病毒DNA为载体所构成的重组DNA，经过体外包装，形成完整的噬菌体或者病毒颗粒，所进行的转导作用称为限制性转导。（2）广义性转导作用----任意DNA片段，或者重组的DNA，经过体外包装成噬菌体颗粒，所进行的转导作用称为广义性转导。3、脂质体介导的融合作用（1）定义（2）脂质体的特性（3）脂质体介导融合的步骤（4）脂质体介导的应用（1）定义将重组的DNA分子包埋于脂质体微囊之中，通过脂质体微囊与宿主细胞的融合作用，而将外源性目的基因转移到宿主细胞内的过程称为脂质体介导的融合作用。（2）脂质体的特性脂质体：人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状结构。原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体颗粒带正电荷，利用引力作用，把DNA、mRNA及单链RNA等导入细胞内主要适用于真核细胞,可对基因进行瞬时表达和稳定表达。（3）脂质体介导融合的步骤分为2步：（A）人工脂质体的制备（B）脂质体与宿主细胞的融合（A）人工脂质体的制备在含有重组DNA分子的水溶液中+磷脂+吐温80（乳化剂）↓通过激烈搅拌或者超声波处理，将磷脂分散到水溶液之中↓再经过静置，磷脂分子群聚形成液晶态脂质双层薄膜↓将DNA包埋在薄膜之中形成微囊。就是人工脂质体。（B）脂质体与宿主细胞的融合将脂质体微囊与宿主细胞混合，在PEG、或者在其它促融剂的作用下，经过一定条件就会产生融合作用，最终将重组DNA导入到宿主细胞之中。（4）脂质体介导的应用对于一些微生物如放线菌细胞，由于无法形成感受态，也就不能通过转化作用导入外源性DNA。但是，通过脂质体介导方法，就能实现脂质体与放线菌细胞之间的融合，来获得基因工程放线菌。脂质体2000:Invitrogen,规格0.75ml/1.5ml报价1700元/2900元4、显微镜注射技术在特定的显微镜下，用特制的玻璃微管，将重组的DNA直接注射到宿主细胞内的方法。显微镜注射技术是一种直接、简单、而又准确、可靠的DNA机械转移技术。主要用于真核生物是一种全新的基因导入技术，它把DNA包被在金或钨的微粒中，然后由基因枪将此包被颗粒转移到原位组织、细胞或细胞器中，是目前国际上最先进的基因导入技术。基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。5、基因枪注射技术基因枪注射技术利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，几乎所有细胞都可用此技术，此方法转染的DNA不仅是线性的，还可是环状的。条件：电压：300～600V维持时间：20～100ms温度：0℃6、电穿孔技术7、磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术此法受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%~5%的外源DNA可进入受体细胞核中，约有1%DNA可在细胞中稳定表达。8、病毒介导的生物学方法带有外源基因的逆转录病毒或DNA病毒在包装细胞内可形成完整的病毒颗粒，并被释放到培养基中，感染哺乳动物细胞，能有效实现基因转移。（三）大肠杆菌中的基因导入和表达1、真核基因导入大肠杆菌所用的载体2、真核基因导入大肠杆菌的具体方式3、影响真核基因导入大肠杆菌的因素1、真核基因导入大肠杆菌所用的载体（1）pBV220（2）pETpBV220侯云德分子病毒学家中国工程院院士1.分离了我国副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型2.研制出包括α1b、α2a、α2b、γ等亚型的基因工程干扰素系列产品3.成功组建原核高效表达载体pBV220系列及pBV320系列通用型高效表达载体（1）pBV220已经成功用于表达IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多种细胞因子。[A]、结构[B]、优点[A]、结构pBV220共3665bp。共