青霉素发酵工艺

青霉素发酵工艺制作人生化制药30904班级李晓清青霉素•青霉素是人类最早发现的抗生素,其杀伤革兰氏阳性细菌的神奇功效几乎人人都曾领教过。它的发现对药物学乃至整个人类发展的重要意义可以说是有口皆碑,以致于人们把青霉素的发现使用列入二十一世纪给人类生活带来巨大变化的科技贡献。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。1929年英国学者弗莱明首先在抗生素中发现了青霉素，英国谢菲尔德大学病理学家弗洛里实现对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，与英国生物化学家钱恩共获1945年诺贝尔奖。青霉素分为天然的和半合成的，天然的青霉素是通过菌种发酵得到的。一、菌种•青霉素最初是从点青霉素产生，生产能力很低，后来找到适于深层培养的产黄青霉菌，经一系列的诱变、杂交、育种，才得到高产的菌种。目前国内青霉素的生产菌种按菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。丝状菌和球状菌对原材料和培养条件的要求有一定的差别，产生青霉素的能力也有差异。球状菌的发酵单位虽高，但对原材料和设备要求较高，且提炼收率也低于丝状菌，因此国内青霉菌生产厂大都采用绿色丝状菌。二、青霉素的工艺流程•丝状菌的青霉素发酵工艺流程：沙土管→斜面母瓶（孢子培养，25℃，6～7d）→大米孢子斜面（孢子培养，25℃，6～7d）→种子罐（种子培养，25℃，40～45h）→繁殖罐（种子培养，25℃，13～15h）→发酵罐（发酵，26℃，6～7d）→放罐•球状菌的青霉素发酵工艺流程：冷冻管→斜面母瓶（孢子培养，25℃，6～8d）→大米孢子斜面（孢子培养，25℃，8～10d）→种子罐（种子培养，28℃，50～60h）→发酵罐（发酵，26℃，6～7d）→放罐三、发酵工艺过程及要点1.种子。丝状菌的生产种子是由包藏在低温的冷冻安管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25℃培养7天，真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内，26℃培养56小时左右，菌丝浓度达6%-8%，菌丝形态正常，即按10%-15%接种量移入含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内，27℃培养24小时，菌丝体积10%-12%，形态正常，效价在700u/ml左右便可作为发酵种子。2.培养基成分的控制a.碳源产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。乳糖能被生产菌缓慢利用而延长青霉素G的分泌期，故为最佳碳源，但因货源少、价格高，大量使用有困难。天然油脂如玉米油、豆油也能被缓慢利用作为有效的碳源，但也不可能达规模使用。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液(DE值50%以上)进行流加。b.氮源氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。在玉米浆中含有多种氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等，为菌体生长提供必要的生长因子。使用玉米浆的发酵效果最好。在发酵时，氨氮的控制在0.05%-0.08%范围内。d.无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等，且用量要适度。另外,由于铁离子对青霉菌有毒害作用,必须严格控制铁离子的浓度,一般控制在30μg/ml。c.前体生物合成含有苄基基团的青霉素G,需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺,一次加入量不大于0.1%,并采用多次加入,以防止前体对青霉素的毒害。国内外青霉素发酵生产作为苄青霉素生物合成的前体有苯乙酸、苯乙酰胺等。它们一部分直接结合到青霉素分子中，另一部分作养料和能源被利用，即被氧化为二氧化碳和水。这些前体物质对青霉菌都有一定的毒性，特别是苯乙酰胺毒性最大。四、发酵培养的控制•a.加糖控制加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的pH值确定,最好是根据排气中CO2量及O2量来控制,一般在残糖降至0.6%左右,pH值上升时开始加糖。•b.补氮及加前体补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素,使发酵液氨氮控制在O.01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为0.05%-0.08%。-•c.pH值控制对pH值的要求视不同菌种而异,一般为pH6.4-6.8,可以补加葡萄糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。d.温度控制前期25-26°C,后期23°C,以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。e.溶解氧的控制一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30%。通风比一般为1:0.8L/(L?min),搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。•f.泡沫的控制在发酵过程中产生大量泡沫,可以用天然油脂,如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂泡敌来消泡,应当控制其用量并要少量多次加入,尤其在发酵前期不宜多用,否则会影响菌体的呼吸代谢•g.发酵液质量控制生产上按规定时间从发酵罐中取样,用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称镜检,根据镜检中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度,通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间,以获得最多青霉素。当菌丝中空泡扩大、增多及延伸,并出现个别自溶细胞,这表示菌丝趋向衰老,青霉素分泌逐渐停止,菌丝形态上即将进入自溶期,在此时期由于茵丝自溶,游离氨释放,pH值上升,导致青霉素产量下降,使色素、溶解和胶状杂质增多,并使发酵液变蒙古稠,增加下一步提纯时过滤的困难。因此,生产上根据镜检判断,在自溶期即将来临之际,迅速停止发酵,立刻放罐,将发酵液迅速送往提炼工段五、影响发酵产率的因素•（1）基质浓度在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制,苯乙酸的生长抑制）,而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成,为了避免这一现象,在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法,即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加,因为即使是超出最适浓度范围较小的波动,都将引起严重的阻遏或限制,使生物合成速度减慢或停止。目前,糖浓度的检测尚难在线进行,故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制,而是间接根据pH值、溶氧或C02释放率予以调节。•（2）温度青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别,但一般认为应在25°C左右。温度过高将明显降低发酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗,降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说,最适温度不是一样的,一般前者略高于后者,故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间,到达生产阶段后便适当降低温度,以利于青霉素的合成。•（3）pH值青霉素发酵的最适pH值一般认为在6.5左右,有时也可以略高或略低一些,但应尽量避免pH值超过7.0,因为青霉素在碱性条件下不稳定,容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中,pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。•（4）溶氧对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高,说明菌丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸强度下降,同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点,而氧消耗与碳能源消耗成正比,故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。•（5）菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度,从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度(取决于维持因数的大小,维持因数越大,呼吸强度越高)、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升,从而提高临界菌体浓度。•（6）菌丝生长速度用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比,当比生长速率高于O.015h-1时,比生产速率与比生长速率无关D因此,要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率,必须使比生长速率不低0.015h-1。这一比生长速率称为临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说,维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每46h就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍,这在实际工业生产中是很难实现的。事实上,青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多,却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶,抵消了一部分生长,故虽然表观比生长速率低,但真比生长速率却要高一些。•（7）菌丝形态在长期的菌株改良中,青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触,故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显著降低,使气-液两相间氧的传递速率大大提高,从而允许更多的菌丝生长(即临界菌体浓度较高),发酵罐体积产率甚至高于前者。•在丝状菌发酵中,控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度,并避免结球,是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中,使菌丝球保持适当大小和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量,也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率六、工业钾盐生产工艺流程•(1)青霉素工业钾盐工艺流程图醋酸丁酯萃取活性炭脱色青霉素滤液——————→一次BA提取液—————→无盐水水洗碳酸钾溶液抽提压滤BA———————→水洗BA———————→共沸结晶双锥干燥钾盐抽提液——————→青霉素钾盐——————→工业钾盐(2)青霉素钠盐流程图醋酸丁酯萃取活性炭脱色青霉素滤液——————→一次BA提取液—————→无盐水水洗碳酸钾溶液抽提压滤BA———————→水洗BA———————→共沸结晶树脂交换钾盐抽提液——————→青霉素钾盐——————→青霉素钠盐无菌过滤、共沸结晶过滤、洗涤、干燥溶液—————————→钠盐结晶液————————→青霉素钠盐成品七、发酵液预处理和过滤•发酵液预处理是抗生素分离纯化的第一道工序。发酵结束后，发酵液中抗生素的浓度通常很低，而杂质的含量通常很高，包括有大量的菌体细胞、未用完的培养基、各种蛋白质胶状物以及其他代谢产物等。发酵液预处理主要去除两大类物质：一类是可溶性物质，包括核酸、杂蛋白质、不溶性多糖等，这些杂质不仅使发酵液粘度提高，影响液固分离速率，而且还会影响提取操作；另一类是某些无机盐，它们不仅影响成品质量，而且在采用离子交换法提取时，由于树脂大量吸附无机离子而减少对抗生素的交换，因此，应将这些无机离子，特别是高价金属离子除去。发酵液放罐后，首先要冷却，因为青霉素在低温时比较稳定，细菌繁殖也比较慢，可避免青霉素迅速被破坏。青霉素菌丝教粗，一般过滤较容易，通常采用鼓式过滤及板框过滤；蛋白质的处理方法包括等电点沉淀、变性沉淀、沉淀剂沉淀、凝聚剂沉淀、絮凝剂沉淀；吸附、酶解法去除不溶性多糖等；高价金属离子的去除方法有离子交换法和沉淀法等。八、青霉素的提取•青霉素的提取方法包括离子交换法、吸附法、沉淀法和溶剂萃取法等。离子交换法利用离子交换树脂作为吸附剂，将青霉素从发酵液中吸着在树脂上，然后在适宜的条件下洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。由于离子交换法具有成本低、设备简单、不用或少用有机溶剂等优点，已成为提取抗生素的重要方法之一。随着大网格聚合物吸附剂的合成和发展，吸附法重新为抗生素工业所重视而获得应用。吸附法具有操作简便、安全、设备简单、不用或少用有机溶剂、生产过程中PH变化小等优点。但吸附法选择性差，收率不高。常规吸附剂按其化学结构可分为两大类;一类是有机吸附剂，如活性炭、纤维素、大孔树脂等；另一类是无机吸剂，如氧化铝