第五章 微生物药物产生菌的菌种选育

育种(strainimprovement)是指为改善种质对原出发菌株(作物)进行的遗传操作。第五章微生物药物的菌种选育微生物药物菌种选育的目的：提高产量组份优化新化合物的获取基因突变是一切突变的内因。任何代谢产物的生成均由遗传因素所决定，产生菌遗传物质的任何变化，都有可能改变其产物的产量和性质。微生物的生理条件、培养条件、发酵条件等在育种发面也有着重要作用。1945时间194319431943195519711977目前发酵单位(U/ml)100250500～850～8000～2万～5万5～10万青霉素诱变史微生物的潜力是无穷的。我们今天所吃的大米，是人类长期以来用人工选择、杂交、辐射诱变、化学诱变等方法改变了水稻“原生态”后生产出来的，是“人定胜天”的结果。我们完全可以利用现有的资源，创造出奇迹。自发突变(spontaneousmutation)：自然条件下,菌株也会发生遗传或生理上的变化而造成产量的改变。突变有着正向和反向的差别。在无性繁殖的细菌中,突变率是用每一个细胞世代中每个细菌发生突变的概率，即用一定数目的细菌在一次分裂过程中发生突变的次数表示,约10-8。不同生物和同一生物个体的不同基因的自发突变率不同。自发突变因素:宇宙射线环境中的低浓度物质温度的改变腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的第六位可以氨基或亚氨基形式出现，而鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的第六位可以酮式或烯醇式出现。平衡一般倾向与氨基和酮基配对，即DNA双链一般以AT,GC为主。自发突变的机理之互变异构效应假说如果A以亚氨基形式出现，在DNA合成到达这一位置的瞬间，通过DNA多聚酶的作用，新合成的DNA链上的相对位置就是C，而不是T。如T以稀有的烯醇式形式出现，则错配G，而不是A。诱变育种(inducedmutation):利用物理或化学诱变剂(mutagen)处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株(mutant)，以供生产科研之用。步骤：出发菌株→诱变→初筛→复筛→放大→获得优良变异株。诱变育种两个主要的环节：诱变(induction)、筛选(screening)经典(常规)育种：诱变育种出发菌株的选择：处理细胞一般为单孢子悬液诱变剂量的选择诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质诱变剂的选择：简便有效1927年,美国遗传学家缪勒(H.J.Muller,1890—1967)首次发现用X射线照射果蝇精子后，果蝇后代发生突变的个体数大大增加。同年,又有科学家用X射线和g射线照射玉米和大麦的种子，也得到了类似的结果。第二次世界大战期间，科学家发现了第一个化学诱变剂——芥子气，开辟了化学诱变的新途径。从此，利用各种物理的和化学的手段进行人工诱变的工作在世界范围内广泛开展起来。诱变处理的兴起高产突变株的筛选：化合物抗菌活性的琼脂块法形态突变株的筛选：去除色素，孢子等自身耐药突变株的筛选：产量越高，对自身的抗性就越强营养缺陷型突变株的筛选：去除反馈抑制结构类似物或前体类似物的筛选：选择对其抗性水平高的变株，可解除反馈抑制而提高产量。突变株的筛选方案的设计五、根据产物特点而设计实验b-内酰胺类抗生素可与某些金属离子螯合而降低其抗菌作用。筛选对高浓度金属离子有抗性的突变株，意味着提高浓度的b-内酰胺类抗生素解除了金属离子的毒性，即得到了高产菌株。浅蓝菌素(cerulenin)通过抑制聚酮体的前体(也是脂肪酸前体)小分子酸类的合成而抑制聚酮体类抗生素的产生，因此筛选在适当浓度的浅蓝菌素琼脂平板上的生长菌落即可能获得高产菌株。将道诺霉素产生菌在一定浓度的浅蓝菌素琼脂平板上生长后，长出的菌落大多数因抗生素的生物合成被抑制而表现为无色，呈现红色的即为产生抗生素的菌落，这样获得高产菌株的机率就得到提高。2004年1月13日，沃尔夫农业奖由中国的袁隆平与美国康奈尔大学的塔克斯莱(StevenTanksley)分享，以表彰他们“对杂交水稻所做出的开创性研究和发现杂交优势的基因原理”。袁隆平从实践及推理中突破了水稻为自花传粉植物而无杂种优势的经典观念的束缚,成为继陈省身(沃尔夫数学奖)及吴健雄(沃尔夫物理学奖)之后第三个中国人。丘成桐,2010沃尔夫数学奖袁隆平屡获国际大奖在于水稻是一种极为重要的农作物，是由于其重大的经济价值，并不意味着中国在生物技术的开发和理论研究方面已走到了世界的前列。恰恰相反，在这些方面我们还与发达国家存在相当大的差距。袁隆平因为发现水稻杂种有优势，进而培育、推广杂交水稻，但是杂交水稻为什么会有优势？水稻杂交优势的遗传基础是什么？这些更根本性的理论研究成果却是坦克斯利做出的。这种理论研究具有更为重大的学术价值，将会对未来的应用开发产生深远的影响。菲律宾的国际水稻研究所已开发出的“金大米”，通过转基因技术让水稻制造β胡萝卜素(维生素A的前体),有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素A缺乏症。国外正在试验用转基因技术提高水稻中铁元素的含量，以减少亚洲妇女常见的贫血症；将玉米基因转入水稻中，大幅度提高水稻的产量和改良稻米的品质等。2005.3,英国剑桥先正达种子公司(SyngentaSeeds)报道了第二代转基因“金大米”胡萝卜素(防止失明)含量增加了20倍。”2009年，中国颁发了具有自主知识产权的一个转植酸酶基因玉米品种，以及两个转抗虫基因水稻品种（世界上首次）的生产应用安全证书。引发公众转基因食品安全性大争论。中国工程院院士范云六：转植酸酶基因玉米可以提高饲料的利用效率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本；减少动物粪、尿中植酸磷的排泄，减轻环境污染，有利于环境保护。此外，利用农业种植方式生产植酸酶，还具有节能、环保、低成本的优势。中国工程院院士张启发：转抗虫基因水稻不仅能有效控制螟虫等鳞翅目害虫危害，保障水稻增产，还能减少80%的化学农药用量。杂交和转基因杂交是同种或近似种之间的交配，两亲不同但不至于差得太远。这里关于种的定义是经典的生殖隔离，但是不必拘泥这个，骡子就是异种杂交的例子。杂交的特征是遗传物质都是在亲本中已经存在的，不同的组合造成不同的性状。转基因在本质上不同。以BT（Bacillusthuringiensis产生的可抵抗水稻抵抗螟虫等虫害的一种毒性蛋白，对人体无害）为例，没有任何亲本中有这个遗传物质，而是人为加入的。这个不是靠时间长短能由自然界替代的过程。有异种之间遗传物质传递的现象，但是很少，也不可预期。自然条件下，作物一般不能获得转基因的特性。科学地看待问题：基于科学知识，而非基于逻辑推论和有选择性的所谓常识经典育种的黄金时代已经过去，现在以及未来属于遗传工程。现代生物技术在微生物药物育种中的应用理性菌种选育(Rationalstrainimprovement)是指在对微生物药物的分子水平的装配、催化、调节等机理透彻了解的基础上,有针对性地进行育种研究。代谢工程是指运用重组DNA技术通过对微生物细胞内的酶、转运和调节等功能进行操作以提高细胞活性的现代生物技术。主要用于有价值的化合物的研究和开发，在能源、原材料、治疗用品的研究和开发等方面也起着重要的作用。运用于药物的研发是一个新兴的领域。代谢工程(metabolicengineering)代谢工程超越了基因扩增和基因表达调控,强调在整体水平对生物合成旁路的观察、代谢旁路的重建、热动力学的稳定性、代谢物转化的速率及其控制。这就将单个的酶反应转向了整体的代谢旁路和生物转化网络。合成异源代谢产物扩大底物利用范围生产非天然的新物质,如新型药物降解环境有害物质提高微生物对环境的适应能力阻断或降低副产物的合成提高代谢产物产率。应用领域金大米从香叶基焦磷酸到b－胡萝卜素的生物合成需要八氢番茄红素合成酶基因、植物八氢番茄红素脱饱和酶基因、－胡萝卜素脱饱和酶基因和八氢番茄红素环化酶基因。Ye(2000)使用来自欧文氏菌的八氢番茄红素脱饱和酶基因（该基因能够同时承担植物八氢番茄红素脱饱和酶基因和－胡萝卜素脱饱和酶基因的功能）替代了相应的两个基因，使得酶促反应步骤由4个减少为3个。Bohmert等在拟南芥中同时表达了来自细菌的分别编码3-酮硫裂解酶(3-ketothiolase)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetacetyl-CoAreductase)和PHA合成酶(PHAsynthase)的三个基因，构建了PHB的生物合成途径，使得转基因拟南芥能够大量产生本来没有的PHB，叶片中的含量达到鲜重的4%(约为干重的40%)。Slater等在拟南芥和油菜种子中表达上述三个基因的同时增加了一个来源于大肠杆菌的苏氨酸脱氨酶(threoninedeaminase)基因，在植物中构建了新的生物合成代谢途径，使得拟南芥和油菜能够产生3-羟基丁酸酯与3-羟基戊酸酯的共聚物(poly3-hydroxybutyrate-CO-3-hydroxyvalerate)。生物塑料代谢工程正被运用于涉及抗生素生物合成的代谢旁路的操纵。产生菌的生物化学和生理学的知识也提供了直接改变代谢的合理基础。有可能通过测量前体和中间产物的代谢流以及鉴别限速步骤以用作遗传操作的靶点。通过分析可将代谢流指向所需的代谢产物并消除不必要产物的生物合成。以模式菌株S.lividans建立了一个代谢流分析模型，目标是阐明次级代谢产物碳源分布的关系，对初级碳代谢进行操作以提高其抗生素的产生。A.提高微生物药物的单位产量增加限速酶所编码的基因的拷贝数：增加限速酶的拷贝数可能增加抗生素的产量。S.clavuligerus中自半胱氨酸，缬氨酸和赖氨酸产生头孢菌素C自身抗性的增加意味着更多抗生素的生成，如将氨基糖甙类抗生素的抗性基因氨基糖苷-6-N-乙酰转移酶基因转化至卡那霉素和新霉素产生菌，转化子对多种氨基糖甙类抗生素的抗性增加，而且卡那霉素和新霉素的产量提高了2-6倍。引入抗性基因表达放线紫红素的途径专一性调节基因act-orf4,基因的拷贝数增加了2倍，而抗生素的产量增加了30-40倍。调节基因的操纵增加正调节基因的拷贝数阻断负调节基因将道诺霉素生物合成的调节基因dnrR1和dnrR2以高拷贝的形式转化至产生菌中，道诺霉素的中间体紫红霉酮的合成量提高了十倍。S.avermitilis可产生抗寄生虫药物多组份的阿维菌素(avermectin)，其中B1是主要的活性成分。Ikeda等使用诱变技术获得了仅产B组份(B1a,B2a,B1b,B2b)的变株K2024,和仅产A组份(A1a,A2a,A1b,A2b)的变株K2021。将这两亲本进行原生质体融合后，获得了只产B1a和B2a组份的融合株K2038。B.阻断代谢旁路，增加有效成分的产量或改善组份的构成进一步，他们利用转座子突变技术选择性地敲除S.avermitilis中毒性化合物寡霉素的生物合成基因，所得菌株只产生阿维菌素。FormationofCHC-CoAinS.collinusGeneticorganizationofthegenesforthebiosynthesisofCHCunitC.合理地设计产生有价值的天然产物的衍生物的生物合成旁路CHCunitisusedforthebiosynthesisofDoramectin不足之处不能提供或很少提供某些产物合成所需的前体物质没有翻译后修饰D.构建能产生中间体或前体的基因工程菌大肠杆菌(E.coli)是最常使用的表达系统:生长迅速(菌体倍增约为20分钟)，发酵设备简单，提取纯化容易，工艺成熟。6-dEB为Sac.erythraea产生的红霉素的前体，原株中产量低Sac.erythraea和E.coli相比较，发酵过程难以扩大化，菌体倍增时间长(4小时),发酵和生产工艺需严格控制。大肠杆菌系统中表达DEBS产生6-dEB如何表达正确折叠和翻译后修饰的PKS。催化表达产生6-dEB的巨大的DEBS蛋白为两个相同的28个活性位点a2b2g2的二聚体,有7个必需磷酸泛酰乙胺化的残基。E.coli没有保证A