第八章_抗生素药物的分析

第八章抗生素药物的分析第一节概述抗生素的概念：具有抑制或杀灭微生物的一类物质。抗生素的特征：生物体在生命活动过程中合成的次级代谢产物。性质不稳定，易降解、聚合纯度一般较低临床上会引起不良反应临床应用广泛，影响大抗生素药品质量研究的项目：性状及鉴别试验，含量测定或效价测定，酸碱度测定，澄明度，水分或干燥失重，安全试验（异常毒性），热原，降压物质，无菌。其他检查：组分、杂质、晶型、比旋度、灰分、重金属、熔点等。抗生素药品分析常用的方法：物理方法:旋光法、紫外、红外、色谱等化学方法（专属性不强）：功能团反应，鉴别和含量的测定。容量分析法：酸碱滴定（青霉素含量测定）和碘量法。生物学方法：酶反应、微生物法测定效价第二节抗生素效价微生物检定法一、微生物检定法定义：是利用微生物发育时对某些物质的特殊依赖性，按这些物质对微生物生长的影响，对他们作出定量鉴定的方法。微生物检定法可分为三类：稀释法（dilutemethod）、比浊法（turbidcomparemethod）、琼脂扩散法（diffusemethod）。与化学方法相比：优点：1、原理与医疗要求基本一致2、对微生物作用直接反映其抗菌活性缺点：1、结果是总效价，无法区分多组分2、时间长，有一定误差，操作繁杂二、抗生素标准效价（potency)单位牛津单位:抑制50毫升肉汤培养基中金黄色葡萄球菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位.一个牛津单位相当于0.6ug的青霉素钠盐所具有的抗生活力，1mg青霉素G钠盐含有1667个牛津单位,(IU)（一）稀释单位(u/ml，u/mg)将1mg抗生素配成溶液，在一定条件下进行稀释，对某一细菌能抑制其生长的最高稀释度，即为1mg抗生素中可含有的单位。（二）重量单位(u/mg)以抗生物有效成分（即生理活性部分）的重量作为抗生素的单位。称重量单位.。如一个链霉素碱单位的重量为1微克，一个青霉素G钠盐的单位的重量为0.6微克。同一种抗生素的各种盐的校价可根据其分子量与标准盐类进行换算而得。青霉素G钾盐的理论效价（U/mg）=钾盐的分子量青霉素钠盐的分子量青霉素钠盐的理论效价青霉素GGG159348.37237.3561667（U/mg）1类似重量单位:以抗生素盐类纯品的重量为单位。包括无生物活性的酸根和金属离子。2重量折算单位以与原始的生物活性相当的纯抗生素实际重量为一个单位，3特定单位以特定抗生素某一批产品的某一重量为一个单位，经有关国家权威机构认可而定.效价测定的方法：一、稀释法（dilutemethod）二、比浊法（turbidcomparemethod）三、琼脂扩散法（diffusemethod）一、稀释法原理：用液体培养基逐级将抗生素稀释，在各管中加入等量的试验菌液，进行培养，观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度，再与同法测定的标准品终点作比较，从而求得被测抗生素的效价。X=(T/S)*CX样品效价(U/ml)T检品液最大稀释倍数S标准品液最大稀释倍数C标准品液效价(U/ml)试管编号12345678910稀释倍数标准品供试品2--4--8--16--32-+64++128++256++512++1024++-：细菌被抑制+：细菌生长X=(T/S)*C=（16/32）*40=20（U/ml)检测终点判断：1、试验菌生长完全抑制2、生长50%抑制3、指示剂变色4、电位差的改变5、菌种的溶血现象等二、比浊法原理：将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内，混匀后，经短期培养（约3-4h），测量培养基浊度，其浊度与细菌数、细菌群体质量存在直接关系，在一定的范围内符合比耳定律。细菌数、细菌群体质量又直接受抗生素效价的影响。影响因素：一、影响比浊法的物理因素1、散射现象2、菌液浓度：3、细菌体大小的变化二、培养基：在没有外加抑制剂的情况下，菌体的生长受培养基的成分、酸度、培养温度、通气等条件影响。一般的试验菌是金黄色葡萄球菌，pH在6.8-7.8。三、培养：温度、振摇。一般培养时间3小时，可缩短为2小时。操作流程如图：基本要点：1培养条件的控制：试管规格均一水浴箱水温均匀，试管按拉丁方排列。2细菌生长误差的控制：3测量时间的控制：各管应先充分混匀，将菌液移入比色皿后静止2分钟后测定。三、琼脂扩散法（diffusemethod）即管碟法管碟法原理:抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成一定浓度抗生素的球型区，抑制试验菌生长，通过透明培养基观察抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比。在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈)进行比较；当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液．对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。根据以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法。从而可以较为准确地测定供试品的效价。抑菌圈的形成M:抗生素在管中的量D：扩散系数T：扩散时间C：最低抑菌浓度H：培养基厚度)4log)21.9/1(log2DTHCrDTMD的影响因素：抗生素本身结构、分子量等，结构简单者容易扩散，分子量大的扩散就慢，杂质：抗生素或培养基中含有杂质，杂质本身也有扩散系统，看干扰抗生素的扩散，影响抑菌圈的大小和清晰度。琼脂含量：含量过多影响抗生素的扩散，过少又使钢管下陷，影响抑菌圈的大小。菌种对抗生素的吸附作用：pH影响分子的形式、温度影响扩散D增大，r也增大)4log(log21.92DTHCMDTrT的影响：一般T增加，r增大，但时间太长影响抑菌圈清晰度。M的影响：在一定的范围内，小管内M越大，抑菌圈直径越大，M还与抗生素的抗菌活性、浓度、钢管的大小、剂型、辅料等有关。C的影响：C越小，抑菌圈直径越大，C与菌种、菌量、培养基、温度等有关H的影响：培养基增厚，则抑菌圈减小。操作中要注意：1试验菌种：挑选合适的敏感菌；用适宜的菌种保存方法；定期对菌种分离纯化；控制菌龄菌量。2培养基：培养基的成分影响抑菌圈的大小和清晰度，pH也很重要。一剂量法（标准曲线法）一剂量法（标准曲线法）原理：在一定范围内，抑菌圈的直径随抗生素浓度的增减而增减。并且抑菌圈的直径与抗生素的对数剂量成线性关系。据此测定抗生素效价。Y=a+bXY:抑菌圈直径A：截距B：斜率X：抗生素浓度的对数。方法：为了消除平板间的差异，在每一平板的含菌培养基上放置6个小钢管，相间的3个小管内加入抗生素标准品的某一浓度（Ck）,他所产生的抑菌圈直径平均值为，另外3个小管内加入标准品的中心浓度（Co）,他所产生的抑菌圈直径平均值为。令fk=这样采用自身对照的方法，可以消除平板间的误差，使结果更加准确。f=a+bX标准曲线的制备：做8个浓度，取24个平皿，分8组，每组3个取平均值。fk对X作图。Yk-YoYkYo检品的效价检定：取3个平皿，每个放6个小管。在间隔的3个小管内加入抗生素标准品的中心浓度(Co),另3个小管内加入估计浓度相当于Co的检品溶液。测量出fk,从标准曲线中计算出检品的浓度，在换算出每毫克的单位数。二剂量法：将抗生素的标准品及检品各稀释成有一定比例的二种剂量（2：1或4：1），即高剂量和低剂量，在同一平板上进行对比，根据所产生抑菌圈大小来计算检品效价的方法。SH:为抗生素标准品高剂量（dS2）所致的抑菌圈直径SL：为抗生素标准品低剂量(dS1)所致的抑菌圈直径UH：为抗生素检品高剂量(dT2)所致的抑菌圈直径UL：为抗生素检品低剂量(dT1)所致的抑菌圈直径WIVantiDlog2SLULSHUHV2SLSHULUHWKLHIlogloglog要求：1、高剂量抑菌圈直径应为20~24nm，个别可为18~24mm，高剂量与低剂量抑菌圈直径之差应大于或等于2mm。2、底层琼脂20ml，上层5ml，每一检品所用平板不少于4个。3、等距安置小钢管4个，相对角为同一物质。4、θ为100±10%（更精确要求100±5%）5、标准品与检品同质三剂量法：应用高、中、低三种剂量，在同一实验条件下比较标准品及检品溶液的抑菌圈大小，以求得检品效价的方法。S3:为抗生素标准品高剂量（dS3）所致的抑菌圈直径S2:为抗生素标准品中剂量（dS2）所致的抑菌圈直径S1:为抗生素标准品低剂量（dS1）所致的抑菌圈直径U3：为抗生素检品高剂量(dT3)所致的抑菌圈直径U2：为抗生素检品中剂量(dT2)所致的抑菌圈直径U1:为抗生素检品低剂量(dT1)所致的抑菌圈直径WIVantiDlog3123123SSSUUUV41313SSUUWKIlog要求：1、标准品中剂量抑菌圈直径15~18mm2、高、中、低剂距为1:0.83、每一检品不得少于6个平皿4、每板上等距安放小钢管6个5、θ:100±10%（100%±5%）三影响抗生素效价管碟法测定结果的因素及其控制（一）影响抑菌圈形状的因素与控制1．稀释抗生素用的缓冲液的PH值、盐浓度的影响.pH值低或含盐浓度高，就会不显抑菌圈或呈卵圆形抑菌圈。这是因为抗生素溶液的盐浓度高或pH值过低，可能改变抗生素分子的解离状态，影响了抗生素对试验菌抑制作用。2．制各琼脂培养基菌层，加菌时培养基温度的影响3．测试用的器材洗净度的影响4双碟培养温度的影响5其他操作的影响（二）影响抑菌圈边缘清晰度的因素与控制1试验菌长时间放置．菌群中的一些菌株生理特性有所变化，或是生长速度改变，或对抗生素的敏感度有所变化，往往出现双圈，抑菌圈的边缘不清。在检定时菌层培养基中的菌量影响抑菌圈，菌层培养基中的菌量过低，抑菌圈边缘模糊不清，菌量过高、使抑菌圈太小并且影响试验菌灵敏度。因此，在正式检测之前，找出最适菌量。2培养基的原材料品种与质量，生测用培养基用的原材料的选择很重要。3调节培养基的pH值或增加适量的盐浓度可使抑菌圈清晰.4．不适当延长双碟的培养时间，使抑菌圈边缘不清。抗生素效价管碟法测定的操作技术操作分为八步：1试验菌的纯化与悬液的制备2缓冲液、灭菌水与培养基的制备3标准品、供试品的称量、溶解与稀释4双碟的制备及放管5滴加药液6恒温培养7测量抑菌圈直径或面积8计算操作流程：四、比浊法与管碟法比较比浊法管碟法优点1、快速1、结果较稳定2、客观、精确2、大批量3、无扩散影响缺点1、对样品洁净度要求高1、扩散因素影响较大2、实验要求较严2、时间长（2天)3、操作繁琐,人为因素的干扰第二节抗生素类药物的鉴别一、β-内酰胺类抗生素的鉴别结构的共同点：1、和内酰胺相邻的碳原子上有一羧基，2、内酰胺中氮原子相对的碳原子上有一功能团氨基。分类：青霉烷类，头孢烯类，碳青霉烯类（硫霉素），单环β-内酰胺（克拉维酸）。鉴别：1、酶法：β-内酰胺酶2、红外吸收光谱法：3000-2800(C-H),3350cm-1(N-H),1800-1600(羰基)，1460-1375（甲基或次甲基）3、紫外吸收光谱法4、茚三酮反应：是α氨基的反应，与茚三酮缩合，生成蓝紫色化合物。5、色谱法：薄层色谱后，氯铂酸与硫醚基反应是灵敏度高的显色试剂二、氨基糖苷类抗生素环己醇配基以糖苷键与氨基糖相连。链霉素，布鲁霉素，卡那霉素，庆大霉素，新霉素。（一）呈色反应1、茚三酮反应：2、坂口反应：链霉素水解产物链霉胍特有。链霉胍，8-羟喹啉分别与次溴酸钠反应，其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。3、糖类反应：莫利西反应脱水α-奈酚糖糠醛红紫色产物4、埃尔松-摩根：样品在强酸或强碱水解后释放出氨基乙糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯样的衍生物，在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液成红色，在540nm处可定量测定。5、麦芽酚反应：水解、重排Fe3+链霉糖麦芽酚紫红色络合物OH-H+三、四环类抗生素结构:氢化四骈苯,四环素，土霉素，金霉素，强力霉素。（一）呈色反应1、浓硫酸反应四环素深紫色；金霉素蓝色至绿色；土霉素朱红色；强力霉素黄色；2、三氯化铁反应：酚羟基（二）荧光反应:土霉素绿色荧光，四环素黄色荧光（三）紫外光谱（四