基因工程的基本操作程序--公开课

1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1.目的基因符合人们需要，能编码蛋白质的基因2.基因文库P9将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库某种生物的全部DNA限制酶DNA片段DNA片段与载体连接重组DNA基因组文库导入受体菌中储存①基因组文库的构建生物某个发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组DNA与载体连接cDNA文库反转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存②cDNA文库的构建-----逆转录法：基因组DNA文库与cDNA文库的比较3.获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性（1）从基因文库中获取目的基因（2）利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。②原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束③过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA在受热下，_____断裂，形成________b、复性（55℃-65℃）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链④方式：以_____方式扩增，即____⑤条件：前提条件:________________⑥结果：指数2n短时间内大量扩增目的基因已知基因的核苷酸序列DNA复制PCR技术场所解旋方式酶PCR技术扩增与DNA复制的比较高温解旋酶体外复制主要在细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶（3）人工合成法：在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学合成法、反转录法蛋白质mRNADNA推测推测DNADNA合成仪合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法：二、基因表达载体的构建（核心）1.目的A.使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代B.同时使目的基因能表达和发挥作用2.基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA3.基因表达载体的构建过程（1）用_________切割质粒，使其出现切口露出____________。（2）用___________切割目的基因，使其产生_________________。（3）将目的基因插入质粒的______处，加入___________，形成了一个重组DNA分子限制酶黏性末端同种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同三、将目的基因导入受体细胞------转化目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程稳定表达受体细胞1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:a.能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力b.Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞整合植物细胞染色体DNA表达新性状转入农杆菌（2）基因枪法------单子叶植物（3）花粉通道法我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞（1）方法：Ca2+处理法（增加细胞壁通透性）（2）微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少（3）过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA四、目的基因的检测与鉴定检测（分子水平）:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:个体生物学水平鉴定（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；A方法:DNA分子杂交B过程:②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。1.检测基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。(2)检测目的基因是否转录出了mRNA①方法:分子杂交法②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:抗原-抗体杂交提取方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养2.鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等目的基因的表达和检测抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等抗原－抗体杂交法DNA-RNA分子杂交法DNA分子杂交法受体是否具有转基因特征个体水平目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否导入分子水平方法检测对象非编码区非编码区编码区外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码编码区非编码区非编码区mRNA前体mRNA单链DNAcDNA转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子