第十一章多肽与蛋白质类药物

第十一章多肽与蛋白质类药物多肽类药物的制备2蛋白质类药物的制备3概述111.1概述生物技术在该类药物中的应用2基本概念111.1.1基本概念•多肽类生化药物是以多肽激素和多肽细胞生长调节因子为主的一大类内源性活性成分。•蛋白质生化药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长的调节，扩展到被动免疫、替代疗法和抗凝血等。•见P154表11-1细胞生长刺激因子11.1.2生物技术在该类药物中的应用•活性多肽和蛋白是生化药物中非常活跃的一个领域，20世纪70年代以后，随着基因工程技术的兴起和发展，人们首先把目标集中在应用基因工程技术制造重要的多肽和蛋白质药物上，已实现工业化的产品有胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、tPA、TNF等，现正从微生物和动物细胞的表达向转基因动、植物方向发展。•见P115表11-2用DNA重组技术生产的人类蛋白药物•见P156表11-3欧美已批准上市的重组人类多肽和蛋白药物11.1.2生物技术在该类药物中的应用11.2多肽类药物的制备多肽药物的制备2多肽类药物111.2.1多肽类药物1.多肽激素2.多肽类细胞生长调节因子3.含有多肽成分的组织制剂11.2.2多肽药物的制备1.降钙素（1）结构与性质•降钙素是由32个氨基酸残基组成的单链多肽，相对分子质量约3500，N端为半胱氨酸，它与7位上的半胱氨酸间形成二硫键，C端为脯氨酸。•降钙素溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳等，难溶于有机酸。25℃以下避光保存可稳定存放两年，水溶液于2～10℃可保存7天。降钙素的活性可被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、多酚氧化酶、H2O2氧化、光氧化及N破坏。11.2.2多肽药物的制备（2）生产工艺①工艺流程11.2.2多肽药物的制备②工艺过程及控制要点•猪甲状腺经绞碎，丙酮脱脂，制成脱脂甲状腺粉27kg，加入01mol/L盐酸1540L，加热至60℃搅拌1h。加水1620L混匀，搅拌1h，离心，沉淀用水洗涤，合并上清液和洗液再搅拌2h后离心。收集上清液，加入15L异戊醇-醋酸-水（20∶32∶48）的混合液，搅匀，加热至50℃，用硅藻土作助滤剂过滤，收集沉淀。沉淀溶于8L0.3mol/L氯化钠溶液中，用10%盐酸调节pH=2.5，离心除去不溶物。11.2.2多肽药物的制备•收集离心液，溶液用10倍水稀释后，通过CMC（5cm×50cm）柱，柱先用0.02mol/L醋酸盐缓冲液（pH=4.5）平衡。收集含有降钙素的溶液，冻干或用2mol/L的氯化钠盐析，制得降钙素粉末，含量为3.6U/mg。在此基础上还可进一步纯化。11.2.2多肽药物的制备③生物活性测定•样品用经过0.1mol/L醋酸钠溶液稀释过的0.1%白蛋白溶液溶解，取0.2mL样品按倍比稀释法配制，选用雄性大白鼠，静脉注射后1h收集血液。血样品的血清钙值采用原子吸收光谱法测定，对照采用从猪甲状腺中提取的MRC标准品。将标准品稀释至所需要的稀释度2.5MRCmU/0.2mL、5MRCmU/0.2mL、10MRCmU/0.2mL和20MRCmU/0.2mL，然后用同样方法给大鼠注射，1h后测定血清钙值。11.2.2多肽药物的制备2.胸腺激素11.2.2多肽药物的制备•临床用于以下方面：①原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染等②自身免疫病，如肝炎、肾病、红斑狼疮、类风湿关节炎、重症肌无力等③变态反应性疾病，如支气管哮喘等④细胞免疫功能减退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老⑤肿瘤的辅助治疗。11.2.2多肽药物的制备（1）结构与性质•胸腺素组分5是由在80℃热稳定的40～50种多肽组成的混合物，相对分子质量在1000～15000之间，等电点在3.5～9.5之间。为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较，根据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名，共分三个区域：α区包括等电点低于5.0的组分，β区包括等电点在5.0～7.0之间的组分，γ区则指其等电点在7.0以上者（此区内组分很少）。11.2.2多肽药物的制备•对分离的多肽进行免疫活性测定，有活性的称为胸腺素，如胸腺素α1，无活性者则称之为多肽，如多肽β1。现已清楚，胸腺素组分5中，胸腺素α1、α5、α7等是具有调节胸腺依赖性淋巴细胞分化和体内外免疫反应的活性组分。11.2.2多肽药物的制备（2）生产工艺①工艺流程11.2.2多肽药物的制备②工艺过程及控制要点•将新鲜或冷冻胸腺除脂肪并绞碎后，加3倍量生理盐水，于组织捣碎机中制成匀浆，14000g离心，得提取液（组分1）。•提取液80℃加热15min，以沉淀对热不稳定部分。离心去掉沉淀，得上清液（组分2）。•上清液冷至4℃，加入5倍体积的-10℃丙酮，过滤收集沉淀，干燥后得丙酮粉（组分3）。11.2.2多肽药物的制备•将丙酮粉溶于pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中，加硫酸铵至饱和度为0.25，离心去除沉淀，上清液（组分4）调pH值为4.0，加硫酸铵至饱和度为0.50，得盐析物。•将盐析物溶于pH=8.0的10mmol/LtrisHCl缓冲液中，超滤，取相对分子质量在15000以下的超滤液。•超滤液经SephadexG-25脱盐后，冷冻干燥得胸腺素（组分5）.(3)活力测定E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%；相对分子质量15000以下。11.2.2多肽药物的制备3.胸腺肽（1）结构与性质胸腺肽是从冷的小牛（或猪、羊）胸腺中，经提取、部分热变性、超滤等工艺过程制备出的一种具有高活力的混合肽类药物制剂。凝胶电泳分析表明，胸腺肽中主要是相对分子质量9600和7000左右的两类蛋白质或肽类，氨基酸组成达15种，必需氨基酸含量高，还含有0.2～0.3mg/mgRNA、0.12～0.18mg/mgDNA。对热较稳定，加温80℃生物活性不降低。经蛋白水解酶作用，生物活性消失。11.2.2多肽药物的制备(2)生产工艺①工艺流程11.2.2多肽药物的制备②工艺过程及控制要点•取-20℃冷藏小牛胸腺，用无菌的剪刀剪去脂肪、筋膜等非胸腺组织，再用冷无菌蒸馏水冲洗，置于灭菌绞肉机中绞碎。•将绞碎胸腺与冷重蒸馏水按1∶1的比例混合，置于10000r/min的高速组织捣碎机中捣碎1min，制成胸腺匀浆。浸渍提取，温度应在10℃以下，并放置-20℃冰冻贮藏48h。11.2.2多肽药物的制备•将冻结的胸腺匀浆融化后，置水浴上搅拌加温至80℃，保持5min，迅速降温，放置-20℃以下冷藏2～3天。然后取出融化，5000r/min离心40min，温度2℃，收集上清液，除去沉渣，用滤纸浆或微孔滤膜（0.22μm）减压抽滤，得澄清滤液。•将滤液用相对分子质量截流值为10000以下的超滤膜进行超滤，收取相对分子质量10000以下的活性多肽，得精制液，置-20℃冷藏。经检验合格，加入3%甘露醇作赋形剂，用微孔滤膜除菌，分装，冷冻干燥即得注射用胸腺肽。(3)活力测定：同胸腺素。相对分子质量10000以下。11.2.2多肽药物的制备4.促皮质素11.2.2多肽药物的制备（1）结构与性质ACTH为39个氨基酸组成的直链多肽，种属差异仅仅表现在第25～33位上。ACTH的24肽即1～24位的片段（ACTH1～24）具有全部活性。ACTH的第24位氨基酸之后的部分，不参与同受体的作用，它仅维持整个多肽结构的稳定性。ACTH可被胃蛋白酶部分水解，水解物因存在着活性片段故仍有活力。ACTH在溶液中存在着高度的α-螺旋。11.2.2多肽药物的制备（2）生产工艺①工艺流程11.2.2多肽药物的制备②工艺过程及控制要点•垂体前叶干粉加0.5mol/L醋酸20倍，用硫酸调节pH=2.0～2.4，70～75℃保温10min，过滤，得提取液。•提取液调pH=3.1，加投料量20%的CMC（2.2mg），3℃搅拌吸附12h，过滤。CMC用0.15mol/L盐酸解吸，解吸液用717阴离子交换树脂处理，过滤，调节pH=3.1，冷藏。11.2.2多肽药物的制备•在洗脱滤液中再加入CMC二次吸附，1～5℃搅拌吸附12h，过滤，CMC用0.1mol/L醋酸、蒸馏水、0.01mol/L醋酸铵（pH=4.6）及0.1mol/L醋酸铵（pH=6.7）分别洗涤，最后用0.15mol/L盐酸解吸。解吸液分别用717阴离子交换树脂及732阳离子交换树脂处理，pH值调到3.0左右，冷冻干燥得ACTH，效价在45U/mg以上。11.2.2多肽药物的制备(3)检验ACTH粗品用小白鼠胸腺萎缩法测定，每1mg相当于1U以上；ACTH精品用去垂体大白鼠的肾上腺维生素C降低法测定，每1mg相当于45U以上。11.3蛋白质类药物的制备主要蛋白质类药物的制备2蛋白质类药物111.3.1蛋白质类药物1.蛋白质类激素2.血浆蛋白3.蛋白质类细胞生长调节因子4.黏蛋白5.胶原蛋白6.碱性蛋白7.蛋白酶抑制11.3.2主要蛋白质类药物的制备1.白蛋白及人血丙种球蛋白（1）结构和性质11.3.2主要蛋白质类药物的制备（2）白蛋白及人丙种球蛋白的生产工艺①工艺流程11.3.2主要蛋白质类药物的制备②白蛋白制备工艺过程及控制要点•络合•解离•分离•超滤•热处理•澄清和除菌•分装11.3.2主要蛋白质类药物的制备③人血丙种球蛋白制备工艺及控制要点•取利凡诺pH=8.6沉淀后的上清部分，在不锈钢反应罐中开启搅拌器，并以1mol/L盐酸调pH=7.0，加23%结晶硫酸铵，充分搅拌后沉淀静置4h以上。•虹吸上清液，将下部混悬液泵入篮式离心机中离心，得沉淀。•将沉淀用适量无热原蒸馏水稀释溶解，在不锈钢压滤机中进行澄清过滤。11.3.2主要蛋白质类药物的制备•以SartoconⅣ超滤器浓缩、除盐。⑤浓缩液在除菌后，静置于2～6℃冷库中存放1个月以上。•以不锈钢压滤器澄清过滤，再通过Sartolis冷灭菌系统除菌。•丙种球蛋白含量及全项检查合格后，灌封机分装，即得人血丙种球蛋白成品。本品内含适宜的防腐剂。有蛋白含量5%与10%两种规格。11.3.2主要蛋白质类药物的制备(3)质量检验①白蛋白的质量检验•性状：本品为淡黄色略带黏稠状的澄明液体或白色疏松物体（冻干品），pH=6.6～7.2•溶解时间：本品冻干制剂配成10%蛋白含量时，其溶解时间不得超过15min。•水分：冻干制剂水分含量不超过1%。11.3.2主要蛋白质类药物的制备•白蛋白含量：应不低于本品规格。•纯度：白蛋白含量应占蛋白含量的95%以上；残余硫酸铵含量应不超过0.01%（g/mL）；无菌试验、安全试验、毒性试验、热原试验均应符合卫生部白蛋白制造及检定规程的规定。11.3.2主要蛋白质类药物的制备②人血丙种球蛋白的质量检验•本品为无色或淡褐色的澄明液体，微带乳光但不应含有异物或摇不散的沉淀，pH=6.6～7.4。•含量：制品中丙种球蛋白含量应占蛋白质含量的95%以上。•稳定性：要求在57℃加热4h不得出现结冻现象或絮状物。•防腐剂含量：酚含量不超过0.25%（g/mL），硫柳汞含量不超过0.005%（g/mL）。11.3.2主要蛋白质类药物的制备•固体总量：制品中固体总量百分数与蛋白质含量百分数之差不得大于2%。•残余硫酸铵含量：不得超过0.1%（g/mL）。•其他：无菌试验、防腐剂试验、安全试验、热原试验应符合规定。11.3.2主要蛋白质类药物的制备2.干扰素（1）干扰素的定义干扰素是由诱生剂诱导有关细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的“免疫力”。因而具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成。11.3.2主要蛋白质类药物的制备（2）分类干扰素根据其来源细胞不同，分为白细胞干扰素（IFN-α）、类淋巴细胞干扰素（IFN-α与IFN-β的混合物）、成纤维细胞干扰素（1FN-β）、T细胞干扰素（又称为免疫干扰）（IFN-γ）等几类。IFN-α型干扰素又以其结构不同再分为IFN-αⅠb