第十一章抗生素类药物的分析

第十一章抗生素类药物的分析第一节概述抗生素的定义抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。一抗生素药物的特点生物发酵，化学纯化，精致，化学修饰等过程，最后制成制剂，结构，组成更复杂。化学纯度低，有三多：同系物多，异构体多，降解物多。发酵过程不易控制。生产工艺复杂易受污染。分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用。活性产物易发生变异。发酵液中杂质无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质[检查]增加异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌二质量分析的测定方法（一）生物学方法1测定抗生素抑菌或杀菌的能力优点1、与临床效果一致2、灵敏度高3、干扰物质少缺点1、操作繁琐2、培养时间长2、测定误差大2化学及物理化学方法以理化方法测定主药含量优点1.准确度高2.简单、快速1.不一定代表生物效价缺点2.易受杂质干扰三分类（按结构与性质）：β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）第二节β–内酰胺类抗生素青霉素类头孢菌素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCOCONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素（青霉素G、苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2氨苄西林（氨苄青霉素）阿莫西林（羟氨苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2普鲁卡因青霉素头孢氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2头孢拉定CH2NH2CONONHSCH3COOH头孢羟氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2HO头孢噻吩钠SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONaNSOHNCOOKCH3CH3OCCH2一结构与性质（一）羧基酸性Na与碱金属(Na+、K+)成盐易溶于水与有机碱(普鲁卡因)成盐难溶于水普鲁卡因青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2NSO1234567（二）手性C旋光性87654321NOS(5%头孢唑啉钠溶液–18～–24°)20D］［青霉素类C3C5C6头孢菌素类C6C7﹡﹡﹡﹡﹡（三）共轭体系UV青霉素类母核无明显UV，多数有苯环取代基头孢菌素类母核有共轭体系NSONOS青霉素钠UV7-20（四）β–内酰胺环干燥纯净时-稳定水溶液：不稳定不稳定性因素四元环张力大酰胺键易水解（某些金属离子）（温度）失效降解青霉素类酸、碱、青霉素酶某些氧化剂例青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类内酰胺酶二鉴别（一）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类NaOHHClNOHH内酰胺类呈色羟肟酸衍生物Fe3+/3H+NSONSCOHNHOHH2NOHHClNSCHNHOFe3+3OH+Fe3+/3（红、棕、褐）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH22.类似肽键的反应茚三酮反应α-氨基蓝紫色氨基茚三酮△α-氨基、伯胺某些羟基胺类酮式烯醇式茚三酮茚三酮缩合蓝紫色+H2OCNCH2RCOH2RCHH2NCOOH2OHCCOCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCOCONH紫内酰胺类碱性酒石酸铜（开环分解）似肽键双缩脲反应β-内酰胺类2OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH蓝紫色3其他显色反应与变色酸-硫酸反应青霉素阿莫西林氨苄西林活泼“-CH2-”HCHOCHSOH”羰基侧链含“△（分解）变色酸显色NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2变色酸阿莫西林HCHOSOH150℃（缩合）色褐SO3HSO3HHOHOSO3HSO3HHOHOOHOHHO3SHO3SCHHCHO（缩合）与重氮苯磺酸反应头孢哌酮橙黄色重氮苯磺酸OHHC（偶合）酚羟基SNOHCONHCHCONHH5C2OONNOCOOHCH2SNNNNCH3NClNNaO3SOH（偶合）NNNNCH3SNOHCONHCHCONHH5C2OONNOCOOHCH2SNNNaO3S与H2SO4-HNO3反应亮黄红棕黄色头孢噻肟钠头孢噻吩钠头孢氨苄HNOSOH头孢菌素类（二）K+、Na+反应焰色→鲜黄色+醋酸氧铀锌→↓黄Na+焰色→紫色+0.1%四苯硼钠+Ac→↓白K+与铜盐反应CuSOHAc头孢氨苄橄榄绿色NaOH专属反应沉淀反应1.遇酸→↓白青霉素青霉素钠　青霉素钾　H在过量HCl或有机溶剂中溶解有机胺盐反应（1）重氮化-偶合反应青霉素普鲁卡因普鲁卡因青霉素H重氮化-偶合反应红芳伯氨基C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCH+C2H52CH2NH2H2NCOOCH2CH2N普鲁卡因普鲁卡因青霉素NCH2CH2OOC2C2H5N+Cl-N2C2H5COOCH2CH2NNH2HClNaNO2（2）与三硝基苯酚反应三硝基苯酚二苄基乙二胺苄星青霉素NaOH△二苄基乙二胺mp三硝基苯酚H2OHOH-HCONSOHNCOOHCH3CH3CH2CH2NCH2CH2NHCH2OHNO2O2NNO2CH2NCH2CH2NHCH2光谱法（三）1、IR法阿莫西林的红外光谱图117401815cm~VOC116901710cm~VOCβ-内酰胺环酰胺青霉素2、UV法样品、分解产物A,Emin,max,,%1cm1光谱图nm339HA苯唑青霉烯酸苯唑青霉素Cu2+头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠A280nm/A264nm=1.30～1.50取本品，加醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH3.8，制成50ug/ml的溶液，取10ml，水浴加热，以未加热的共试品为空白。测定，吸收度0.6。NOCONHCH3NOSCH3CH3COONaNOCHCH3OCOCNHNCHHCCH3CH3SHCHCOOHCu2+pH3.8△氯唑青霉素3410.682双氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328max%1cm1E(nm)ml/g50（四）色谱法对照品对照法1、TLC法和斑点颜色比较供试品对照品相同条件fR2、HPLC法Rt比较供试品对照品相同条件三特殊杂质的检查（一）聚合物中国药典规定，头包曲松，哌酮，噻肟需检查聚合物。用HPLC，以他啶为例。对照溶液的制备取对照品适量，精密称定，加水制成100ug/ml溶液，摇匀。测定法取对照品适量，精密称定，加水制成，20ug/ml进样。含聚合物不得超过头孢他定的0.3%。（二）有关物质和异构体（P273）头孢氨苄中有关物质的检查（反相TLC法）头孢氨苄以青霉素钾为原料，经氧化、扩环、裂解得7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA），再与侧链a-苯甘氨酸缩合而成。这两种原料有可能成为主要杂质。用茚三酮显色，a-苯甘氨酸和7-ADCA斑点显橙黄色。（三）杂质吸收度的检查青霉素钠（钾）：取本品，加水，1.80mg/ml。280nm不得大于0.10，264nm应为0.80-0.88。264nm的吸收值用来控制青霉素钠（钾）的含量。280nm的吸收用来控制杂质。四、含量测定碘量法（一）β-内酰胺类ChP利用其分子本身不消耗碘，而降解产物消耗碘，用剩余碘量法测定，以标准对比法计算。IINaOH头孢菌素族青霉素族（水解）H1.原理水解产物OSNaNaIOSNaI＋＋定量过量剩余反应分两步进行：1.水解反应(按化学计算量进行)2.氧化-还原反应(无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定)NSCH3CH3COOHOHNRCORCOHHNCOONaCH3CH3SNCOONaI24+5H2O+2HClNaOHCCH3CH3SO3HCHNH2COOHCHNHCORCOOH2+2NaCl++8HI第一步第二步例注射用普鲁卡因青霉素含量测定取装量差异项（药典附录P7）下的内容物，精密称取约0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟，再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，摇匀，在20～25℃暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。V样空V样对照液+缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴V对空V对供试液+缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴2.方法空白试验A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C、消除碘挥发造成的误差以未经水解的样品作空白测定空白样品I2Na2S2O3I-I2采用标准品平行对照测定A、可消除温度、pH、操作、环境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定法一致3.条件（1）弱酸性pH4.5碱↑I2→IO3-+I-酸↑普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐沉淀（2）温度24～26℃温度＞38℃未水解的供试品亦消耗碘（3）水解时间以水解20分钟后的耗碘量最大（4）反应时间反应20分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误差。（1）灵敏度高样品:碘=1:8（2）反应条件、实验操作要求高V对、V对空V样、V样空1份含量4I2→8I-4.特点加试剂次序、反应时间、滴定速度相同%WWVVVV对照品）（）（含量％＝样对对对空样样空5.计算原料降解产物或杂质可消耗碘而影响测定，因此用未经水解的样品做空白。碘量法是青霉素族的经典的测定方法。1.原理SHROH青霉素族（水解）HgRS）（ChP青霉素族Hg.pH（二）电位配位滴定法（汞量法）2.方法总样VNOHgHNONaOH醋酸盐缓冲液pH4.6滴定水解降空醋酸盐缓冲液VNOHgpH4.6滴定样品以未经水解的样品作空白测定例苯唑西林钠含量测定取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法(附录ⅦA),用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在35～40℃，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定，（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于8.029mg的总苯唑西林(按C19H19N3O5S计算)。另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于8.029mg的降解物（按C19H19N3O5S计算）