第十三章生化药物制造工艺氨基酸类药物

第十三章生化药物制造工艺一、氨基酸类药物概述及分类氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位。自20世纪50年代开始，氨基酸应用范围不断扩大，形成了一个朝气蓬勃的新兴工业体系，被称为氨基酸工业，生产技术日新月异，品种和产量逐年增加。目前，全世界氨基酸的年产量已超过200万吨。其品种已由构成蛋白质的20多种，发展到100多种氨基酸衍生物。氨基酸广泛应用于医药、食品、保健、饲料、化妆品、农药、制药、科学研究等领域。日本氨基酸工业生产在世界上居领先地位，其产量约占世界总产量的35％，品种主要有26种，几乎都用作医药原料。我国药用氨基酸年产量约4000多吨，占世界总产量的1％左右，但销售额占氨基酸产品总额的18％～20％。在一定程度上说，药用氨基酸作为发展中的产业，“永不衰退”的医药产品市场潜力很大。（一）分类依据天然是否存在和人体能否合成可分为：1、蛋白质氨基酸自然界中，有一类氨基酸存在于动物、植物和微生物的蛋白质里，是构成天然蛋白质的组成成分，大约有20种，被称为蛋白质氨基酸。其游离存在的甚少，绝大多数都以结合状态存在。在基因DNA中，含有它们的特异遗传密码且能为其编码的氨基酸，称为编码氨基酸。根据蛋白质氨基酸的化学结构又可分为脂肪族氨基酸；芳香族氨基酸；杂环族氨基酸。根据氨基酸分子中氨基和羧基的数目不同，可分为酸性氨基酸；碱性氨基酸；中性氨基酸。所谓酸性氨基酸、碱性氨基酸都是相对其分子中性而言，由于羧基的游离度大于氨基，在pH7的纯水中，多数略小于7而呈酸性。2、非蛋白氨基酸自然界中，还存在一些特殊的氨基酸，不是蛋白质的组成成分，多以游离形式存在。至今已发现有450种以上非蛋白氨基酸。其中存在于植物中的约有240种，存在于动物中的有50种，其他多存在于微生物中，还不断有新发现的这类氨基酸问世。3、衍生氨基酸经酶催化修饰或化学修饰，在氨基酸的活性基团上进行甲基化、乙基化、乙酰化、酰胺化、磷酸化等（由此形成氨基酸衍生物）。4、必需氨基酸和非必需氨基酸依据人体能否合成划分，氨基酸可分为必需氨基酸和非必需氨基酸。不同的生物，要求的必需氨基酸也不同。人类必需氨基酸有亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸8种。精氨酸、组氨酸在人体内合成速度很低，要给予补充，故又称半必需氨基酸。（二）氨基酸及其衍生物在医药中的应用氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，故生物体中众多蛋白质的生物功能，无不与构成蛋白质的氨基酸种类、数量、排列顺序及由其形成的空间构象有密切的关系。因此氨基酸对维持机体蛋白质的动态平衡有极其重要的意义。现就某些氨基酸及其衍生物的营养价值及临床应用简述如下：1、氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系氨基酸为构成天然蛋白质的基本单位，故蛋白质营养价值实际是氨基酸作用的反映。健康人靠膳食中的蛋白质获取各种氨基酸满足机体需求。临床上常通过直接输入氨基酸制剂改善患者营养状况，增加治疗机会，促进康复。2、治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物3、治疗肝病的氨基酸及其衍生物4、治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物5、用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物6、其他氨基酸类药物的临床应用二、氨基酸类药物的制造方法目前构成天然蛋白质的20种氨基酸的生产方法有天然蛋白质水解法、发酵法、酶转化法及化学合成法等四种。氨基酸及其衍生物类药物己有百种之多，但主要是以20种氨基酸为原料经酯化、酰化、取代及成盐等化学方法或酶转化法生产。（一）水解法1、基本原理与过程水解法是最早发展起来的生产氨基酸的基本方法。它是以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法。（1）蛋白质水解目前蛋白质水解分为酸水解法、碱水解法及酶水解法三种。①酸水解法。蛋白质原料用6～10mol／L盐酸或8mol／L硫酸于110～120℃水解12～24h，除酸后即得多种氨基酸混合物，此法优点是水解迅速而彻底，产物全部为L－型氨基酸，无消旋作用。缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸部分被破坏，且产生大量废酸污染环境。②碱水解法。蛋白质原料经6mol／L氢氧化钠或4mol／L氢氧化钡于100℃水解6h即得多种氨基酸混合物。该法水解迅速而彻底，且色氨酸不被破坏，但含羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用③酶水解法。蛋白质原料在一定pH和温度条件下经蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的过程称为酶水解法。此法优点为反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不破坏，无消旋作用。缺点是水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含较多肽类。工业上很少用该法生产氨基酸而主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。（2）氨基酸分离氨基酸分离方法较多，通常有溶解度法、等电点沉淀法、特殊试剂沉淀法、吸附法及离子交换法等。①溶解度法。是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异而进行分离的方法。如胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，但在热水中酪氨酸溶解度较大，而胱氨酸溶解度变化不大。②特殊试剂沉淀法。系采用某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物的分离方法。如邻二甲苯－4－磺酸能与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，后者与氨水反应又可获得游离亮氨酸；组氨酸可与HgCl2形成不溶性汞盐沉淀，后者经处理后又可获得游离组氨酸；精氨酸可与苯甲醛生成水不溶性苯亚甲基精氨酸沉淀，后者用盐酸除去苯甲醛即可得精氨酸。④离子交换法。是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异进行分离的方法。氨基酸为两性电解质。（3）氨基酸的精制分离出的特定氨基酸中常含有少量其他杂质，需进行精制，常用的有结晶和重结晶技术，也可采用溶解度法或结晶与溶解度法相结合的技术。2、用水解法生产氨基酸的品种及工艺绝大多数氨基酸均可采用酸水解法生产。1、L-胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制备（1）L-胱氨酸的结构与性质L-胱氨酸存在于所有蛋白质分子中，尤以毛、发及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由两分子半胱氨酸脱氢氧化而成，结构为：L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶体，分解点258~261℃，pI为5.05，〔α〕25D为-232°。在25℃水中溶解度为0.011，在75℃水中为0.052。溶于无机酸及无机碱，在热碱液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮。可被还原为L－半胱氨酸。（2）工艺路线（5）作用与用途L一胱氨酸具有增强造血功能、升高白细胞、促进皮肤损伤的修复及抗辐射作用。临床上用于治疗辐射损伤、重金属中毒、慢性肝炎、牛皮癣及病后或产后继发性脱发。（二）发酵法现在20多种氨基酸绝大多数都可以用发酵法生产或试生产。氨基酸发酵法有广义与狭义之分。狭义者系指通过特定微生物在以糖为碳源、以氨或尿素为氮源以及其他成分的培养基中生长，直接产生氨基酸的方法。广义者除直接发酵法外，尚包括添加前体发酵法及酶转化技术生产氨基酸法。在此仅简述直接发酵法。1、基本原理与过程（1）发酵的基本原理生物化学中称酵母无氧呼吸过程为发酵，反应过程中电子供体与受体皆为有机物。工业上，发酵就是微生物纯种培养过程，实质上是利用微生物细胞中酶的作用，将培养基中有机物转化为细胞或其他有机物的过程，且有厌氧及好氧发酵之分，氨基酸发酵属好氧的不完全氧化过程。微生物通过固氮作用、硝酸还原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相应的氨基酸，称为初生氨基酸。微生物通过转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移到另一种α－酮酸上，生成的新的氨基酸亦称为初生氨基酸。在微生物作用下，以初生氨基酸为前体转化成的其他氨基酸称为次生氨基酸。因此，大多数氨基酸均可通过以初生氨基酸为原料的微生物转化作用而产生。另外，有些氨基酸可以有机化合物和氨盐为前体，在相应酶作用下而产生。（2）发酵法的基本过程发酵法生产氨基酸的基本过程包括培养基配制与灭菌处理、菌种诱变与选育、菌种培养、灭菌及接种发酵、产品提取及分离纯化等步骤。氨基酸发酵中，菌种主要为细菌，其次为酵母属，现代生物工程采用细胞融合技术及基因重组技术改造微生物细胞，已获得多种高产氨基酸杂种菌株及基因工程菌。氨基酸发酵方式主要是液体通风深层培养法，是由菌种试管培养逐级放大直至数吨至数百吨发酵罐。其分离纯化及精制方法和过程均与水解法相同。2、发酵法生产的氨基酸品种及工艺微生物利用碳源、氮源及盐类几乎可合成所有氨基酸。目前绝大部分氨基酸皆可通过发酵法生产，其缺点是产物浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产周期长，成本高。L－赖氨酸的制备（1）L－赖氨酸的结构与性质L－赖氨酸存在于所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一。分子量为146.20，结构为：L-Lys自乙醇水溶液中得针状结晶，其盐酸盐为单斜晶系白色粉末，无臭、味苦，熔点263～264℃，易溶于水，几乎不溶于乙醇和乙醚。PI为10.56。含量测定：采用电位滴定法。（5）作用与用途L－赖氨酸盐酸盐为人体必需氨基酸之一，是氨基酸类药物，也是复合氨基酸注射液的重要成分之一。（三）酶转化法酶法是20世纪70年代兴起的生产方法，它是利用生物酶催化的立体专一性反应，从底物生产光学活性的氨基酸。1、基本原理及过程酶转化法亦称为酶工程技术，实际上是在特定酶的作用下使某些化合物转化成相应氨基酸的技术。本法基本过程是利用化学合成、生物合成或天然存在的氨基酸前体为原料，同时培养具有相应酶的微生物、植物或动物细胞，然后将酶或细胞进行固定化处理，装填于适当反应器中制成所谓“生物反应堆”。酶工程法与直接发酵法生产氨基酸之反应本质相同，皆属酶转化反应，但前者为单酶或多酶的高密度转化，而后者为多酶低密度转化。2、酶转化法生产的氨基酸品种及工艺目前医药工业中，用酶工程法生产的氨基酸已有十多种。酶转化法制备L－天冬氨酸和L－丙氨酸1、L-天冬氨酸及L-丙氨酸的制备（1）L-天冬氨酸及L-丙氨酸的结构与性质①L－天冬氨酸（L-Asparticacid，Asp）的结构与性质L-Asp存在于所有蛋白质分子中，含两个羧基和一个氨基，为酸性氨基酸，分子式为C4H7NO4，分子量为133.10，结构式为：L-Asp的化学名称为α-氨基丁二酸或氨基琥珀酸，纯品为白色菱形叶片状结晶，等电点为2.77，熔点为269～271℃。溶于水及盐酸，不溶于乙醇及乙醚，在25℃水中溶解度为0.8，在75℃水中为2.88，在乙醇中为0.00016。在碱性溶液中为左旋性，在酸性溶液中为右旋性。〔α〕25D为+5.05°（C＝0.5～2.0，在水中），〔α〕25D为+25.4°（C＝0.5～2.0，在5mol／LHCl中）。②L-丙氨酸（L-Alanine，简称L-Ala）的结构与性质L-Ala存在于所有蛋白质分子中,为中性氨基酸。分子式为C3H7NO2，分子量为89.09，结构式为：L-Ala自水和乙醇中形成菱形结晶，等电点为6.0，分解点为297℃，在25℃水中溶解度为16.65，在75℃水中为28.5，在20℃乙醇中为0.16，不溶于丙酮及乙醚。〔α〕25D为+18°（C＝0.5～2.0，在水中），〔α〕25D为-14.6°（C＝0.5～2.0，在5mol／LHCl中）。（2）L-Asp和L-Ala的酶转化反应（3）工艺路线（6）作用与用途L－Asp有助于鸟氨酸循环，促进氨和CO2生成尿素，降低血中氨和CO2，增强肝功能，消除疲劳，用于治疗慢性肝炎、肝硬化及高血氨症。同时L－Asp和L－Ala都是复合氨基酸输液的原料。（四）化学合成法氨基酸都是低分子化合物，采用化学合成手段制造氨基酸占有一定的地位。化学合成法是以原料，经氨解、水解、缩合、取代及氢化还原等化学反应合成α－氨基酸的方法。氨基酸种类较多、结构各异，故不同氨基酸的合成方法也不相同。不过通常可归纳为一般合成法和不对称合成法两大类。一般合成法的产物皆为DL－型氨基酸混合物，需进行拆分才能得到L－型产品，不对称合成法产物为L－型氨基酸。理论上所有氨基酸皆可由化学合成法制造。三、氨基酸输液多种结晶L－氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液称为氨基酸输液。当由于疾病等原因，不能经口摄取的时候，把纯度高的氨基酸混合液作为最合适的氮源，从静脉注入身体是比较合理的营养补给方法。现已有含氨基酸数目为6、9、11、14、15