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第十二章核酸类药物主要核酸类药物的生产2概述112.1概述核酸类药物的生产方法2核苷酸的生物合成及其代谢调节3基本概念112.1.1基本概念12.1.1基本概念12.1.2核酸类药物的生产方法1.酶解法2.半合成法3.直接发酵法12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节1.嘌呤核苷酸的生物合成途径(1)嘌呤核苷酸的生物合成途径见P184图12-2嘌呤核苷酸的生物合成途径及有关的酶(2)嘌呤、核苷酸生物合成系的突变12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节2.嘧啶核苷酸的生物合成途径12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节3.核苷酸合成的补救途径12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节4.嘌呤核苷酸生物合成的代谢控制(1)肌苷酸生物合成的代谢控制12.1.3核苷酸的生物合成及其代谢调节(2)嘌呤核苷酸互变的代谢控制12.2主要核酸类药物的生产三磷酸腺苷的制备2核苷类药物的制备3RNA与DNA的提取与制备112.2.1RNA与DNA的提取与制备1.RNA及其工业来源(1)高产RNA菌株的筛选12.2.1RNA与DNA的提取与制备(2)影响RNA产量的因素12.2.1RNA与DNA的提取与制备(3)RNA提取(以酵母提取RNA为例)12.2.1RNA与DNA的提取与制备2.DNA的提取与制备(1)工业用DNA的提取取新鲜冷冻鱼精20kg,用绞肉机粉碎成浆状,加入等体积水,搅拌均匀,倾入反应锅内,缓慢搅拌,升温至100℃,保温15min,迅速冷却至20~25℃,离心除去鱼精蛋白等沉淀物,获得35L含热变性DNA的溶液,经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA,在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95%乙醇,离心可获得纤维状DNA,沉淀用乙醇、丙酮洗涤,减压低温干燥得DNA粗品,产品含50%~60%热变性DNA。12.2.1RNA与DNA的提取与制备(2)具有生物活性DNA的制备•动物内脏(肝、脾、胸腺)加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1min,匀浆于2500r/min离心30min,沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次,每次洗后离心,将沉淀悬浮于20倍量的冷生理盐水中,再捣碎3min;加入2倍量5%的十二烷基磺酸钠(用45%乙醇作溶剂),并搅拌2~3h,在0℃,2500r/min离心,在上层液中加入等体积的冷95%乙醇,离心即可得到纤维状DNA,再用冷乙醇和丙酮洗涤,减压低温干燥得粗品DNA。12.2.1RNA与DNA的提取与制备•粗品DNA溶于适量蒸馏水,加入5%的十二烷基磺酸钠(用45%乙醇作溶剂)达1/10体积,搅拌1h,经5000r/min离心1h,清液中加入NaCl达1mol/L,再缓慢加入冷95%乙醇,DNA析出,经乙醇、丙酮洗涤,真空干燥得具有生物活性的DNA。活性DNA制备需在0~3℃下操作完成。12.2.2三磷酸腺苷的制备1.以嘌呤为前体生产ATP的工艺流程及控制要点12.2.2三磷酸腺苷的制备(1)发酵生产腺苷①生产菌种直接发酵生产腺苷的菌种应为具备Xan-+Gu-+dea-+8AGr+Np-遗传标记的枯草杆菌菌株。②培养基培养基的碳源以葡萄糖为佳,若添加少量核糖,可增加腺苷的产量。12.2.2三磷酸腺苷的制备(2)微生物磷酸化生产AMP和ATP12.2.2三磷酸腺苷的制备2.直接发酵生产ATP的工艺及控制要点(1)菌种采用产氨短杆菌ATCC6872菌株进行发酵。(2)种子培养以葡萄糖3%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、NaCl0.25%为种子培养基,于30℃振荡培养24h,即得种子培养液。12.2.2三磷酸腺苷的制备(3)发酵培养基葡萄糖10%、KH2PO41.0%、K2HPO41.0%、MgSO4·7H2O1.0%、ZnSO4·7H2O0.001%、CaCl2·2H2O0.01%、FeSO4·7H2O0.001%、胱氨酸0.002%、β-丙氨酸0.0015%、生物素30μg/L、硫胺素盐酸盐0.5mg/L、尿素0.2%.(4)发酵培养在5L培养罐中,装入3L培养基灭菌后,接种上述种子培养液300mL,培养时用氨水调pH=68,于32℃通气搅拌培养。培养1天后添加腺嘌呤3g/L及适当的表面活性剂,再培养2天后,ATP发酵产量可达8g/L。12.2.3核苷类药物的制备1.肌苷发酵生产(1)生产菌种12.2.3核苷类药物的制备(2)肌苷产生菌的选育12.2.3核苷类药物的制备(3)肌苷发酵工艺及控制要点①碳源大多使用葡萄糖②常用的氮源有氯化铵、硫酸铵或尿素等③磷酸盐对肌苷生成有很大影响④肌苷生产菌株一般为腺嘌呤缺陷型菌株,因此培养基中必须加入适量的腺嘌呤或含有腺嘌呤的物质⑤氨基酸有促进肌苷积累,同时节约腺嘌呤用量的作用⑥培养基以外的发酵条件,如pH值、温度、通气搅拌等也都是影响肌苷积累的重要条件12.2.3核苷类药物的制备2.聚肌胞苷酸(聚肌胞)(poyinosinic,polycytidylicacid,pI∶C)的生产•20世纪70年代中期我国开始研制聚肌胞,其生产工艺流程如下:底物预处理酶促反应分离等物质的量poly→I和poly→C混合12.2.3核苷类药物的制备(1)底物5′-核苷二磷酸吡啶盐的制备流程12.2.3核苷类药物的制备(2)固定化多核苷酸磷酸化酶的制备①酶的制备②固相载体的制备③固定化多核苷酸磷酸化酶12.2.3核苷类药物的制备(3)polyI∶C制备①底物预处理。CDP吡啶盐转化成锂盐,IDP转化成钠盐②酶促反应。每毫升反应液含以下物质的浓度(μmol/L)为:IDP或CDP15;tris150;MgCl26;EDTA1;聚合酶5U。pH=9.0,37℃,3~4h。用盐酸调pH=1.5~2.0,使polyI(或polyC)沉淀,立即离心。此后在磷酸缓冲液中溶解,等物质的量polyI与polyC混合,生成产品。
本文标题:第十二章核酸类药物
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