第四章中药制剂的含量测定

第四章中药制剂的含量测定药物分析教研室第一节含量测定的目的与意义在我国药品质量标准中，[鉴别]、[检查]和[含量测定]项目是判定中药制剂质量优劣的标准。中药制剂的鉴别是研究某种原料药或成分的存在与否，从而判定药物的真伪，而含量测定项目是研究某种成分的含量高低是否符合规定来判定药物的优劣。中药制剂的含量测定是质量控制中的一项重要指标。通过测定制剂中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣，以保证中药制剂的质量，达到临床用药安全、有效和中药制剂进入国际市场的需要。第二节含量测定样品的处理中药制剂样品的基质和成分组成十分复杂，而且样品中被测成分往往含量较低，因此需要对样品进行各种处理，使其符合所选定分析方法的要求。样品处理的主要作用有：将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和准确度。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。第二节含量测定样品的处理一、样品的粉碎样品的粉碎有两个目的：是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度；是使样品中的被测组分能更快地完全提取出来。粉碎时注意事项：不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，因此可视实际情况进行粉碎过筛。避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损或不干净等原因而玷污样品，防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。过筛时，通不过筛孔的部分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎或碾磨，让其全部通过筛孔。第二节含量测定样品的处理二、样品的提取对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。下面介绍几种常见的提取方法：冷浸法回流提取法连续回流提取法超声提取法超临界流体提取法第二节含量测定样品的处理（一）冷浸法按所需准确度要求称取一定量样品置于带塞容器内，摇匀后放置，浸泡提取，溶剂用量为样品重量的10～50倍，并称重。浸泡时间12～24小时，浸泡期间应注意经常振摇，浸泡后再称重，补足溶剂充分摇匀，浸泡后的溶液，可取部分测定，也可全部测定。部分测定法（即等量法）是将浸泡后的溶液，用适宜滤器过滤，精密量取一定量体积的滤液，与一定重量的样品相当，进行测定。此法不适宜挥发性较大的提取溶剂。全部测定法（即总量测定法）是将浸泡后的溶液滤过，滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全，合并滤液及洗液，浓缩或蒸干得残留物用另一溶剂溶解，定量转入容量瓶，稀释至刻度，摇匀，进行测定。此法可克服部分测定法的缺陷，且提取时溶剂用量不必精密加入。（一）冷浸法另外全部测定法中提取液的浓缩蒸干，可根据具体情况采用下列方法：常压或减压蒸发，后者具有温度低、速度快，适于对热不稳定样品之优点；自然挥散或氮气流下吹干。适于小体积样品和挥发性溶剂，氮气流能防止氧化；冷冻干燥（常为水溶液），更适于热不稳定的样品。冷浸法的优点是操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少。其缺点是费时、费溶剂。第二节含量测定样品的处理（二）回流提取法它是将冷浸法中的带塞容器换成回流装置，用单一溶剂或混合溶剂于水浴上加热回流提取，其余操作方法同冷浸法。优点：1、提取效率高于冷浸法；2、且可缩短提取时间，每次提取时间为0.5～2小时，直至提取完全为止。缺点：1、提取杂质较多；2、该法对热不稳定或具有挥发性的成分不宜使用。第二节含量测定样品的处理第二节含量测定样品的处理（三）连续回流提取法样品置索氏提取器中，利用遇热可以挥发的溶剂进行反复提取（相当于总是在使用新鲜溶剂提取），一般提取数小时方可完全。优点：1）无需过滤，提取完全后取下虹吸回流管，就可回收溶剂，再用适宜溶剂溶解，定容，进行测定。2）提取效率高，所需溶剂少，提取杂质少，操作简便。缺点：受热易分解的成分不宜使用。第二节含量测定样品的处理（四）超声提取法样品置适当的容器中，加入提取溶剂，放入超声振荡器中进行提取。一般样品30分钟内即可完成，最多不超过1小时。优点：超声提取能使样品粉末更好地分散于溶剂中提高提取效率和提取速度。（超声的助溶作用）缺点：促使化学反应发生（如氧化还原反应、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。对于由浸膏制成的固体制剂，用上述方法提取时，通常是精密称取适量药粉于量瓶中，定量加适当溶剂提取后，以干燥滤纸过滤，弃去滤液，取续滤液（防止滤纸吸附或污染被测组分），按部分测定法测定。第二节含量测定样品的处理（五）超临界流体提取法（Supercritical-fluidextraction,SFE）它是以超临界流体（常用CO2）作提取溶剂，有效、快速提取固体或半固体中的被测成分的样品预处理新技术。超临界流体（SF）是指高于临界压力（Pc）和临界温度（Tc）时所形成的单一相态，它既不是液体，又不是气体，而具如下特性：1)对样品组分溶解能力强。超临界流体（SF）的密度与液体的相近（如CO2超临界流体的密度为0.3～0.9g/cm3），而其具有与液体相似的溶剂作用；2)有利于样品中的被测成分扩散进入SF中。SF的粘度与气体相近，比液体的略低2个数量级，扩散系数却比液体的高1个数量级以上，使其具有良好的传质性能；3)SF能使提取效率和提取速度大大提高。SF的表面张力几乎为零，而较容易渗透进样品基质空隙中，有利于SF与样品的充分接触；4)同一种SF在不同温度和压力下可以提取极性或分子大小都不相同的化学成分。SF的密度、粘度和扩散系数等都与温度、压力和流体组成有关。温度和压力稍高于临界点时，SF的压缩系数最大，压力的微小变化将导致较大的密度变化，而控制密度就可控制SF对溶质的溶解能力，目前也常用升压力（即升密度）提取法进行分步提取。最常用的SF是CO2，它的性质稳定，使用安全，价格低廉，临界点低（Tc=31℃和Pc=7.4MPa），易于操作。第二节含量测定样品的处理第二节含量测定样品的处理SFE具有优点：速度快萃取效率高、方法准确度高、选择性较高、节省溶剂、易于自动化，可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，能与色谱和光谱等分析仪器直接联用的特点。SFE不仅常用于热不稳定成分或挥发性成分的萃取，而且也越来越多地用于热稳定性成分的萃取。缺点：对设备要求高。第二节含量测定样品的处理三、样品的分离净化（一）沉淀法原理：它是基于某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液以得到精制的方法。这种方法须注意：1）过量的试剂若干扰被测组分的测定，则应设法除去；2）大量杂质以沉淀形式除去时，被测成分应不因产生共沉淀而损失；3）被测组分生成沉淀时，其沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定。第二节含量测定样品的处理（二）蒸馏法原理：利用某些被测成分具有挥发性，可采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定，或某些成分经蒸馏分解生成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。目前以水蒸气蒸馏法应用较多。1）它可分为共水蒸馏法（即直接加热法）、通水蒸汽蒸馏法和水上蒸馏法。如中药制剂中的挥发油，某些小分子生物碱（麻黄碱、於碱、槟榔碱）及丹皮酚等，都可用蒸馏法提取和分离净化。2）为了使挥发性成分更完全地蒸馏出来，有时也可用盐析作用，即在蒸馏液中加入一定量的无机盐，常用NaCl、NaSO4、MgSO4等。第二节含量测定样品的处理（三）液一液萃取法（LLE）常用的两种LLE方法是有机溶剂直接萃取法和离子对萃取法。⒈直接萃取法原理：利用试样中被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取来达到分离净化的目的。多次萃取虽然有利于提高萃取回收率和结果的准确度，但多次溶液转移等操作又会带来误差。有时对于组分复杂，含量低的样品，由于样品数量多，多次萃取费时等原因，只要每次测得的回收率重现性好，常在可接受的回收率前提下可采用单次提取。直接萃取法常用的溶剂有氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯和乙醚等。可根据被测组分疏水性的相对强弱来选择极性适当的溶剂，既保证被测组成的充分萃取，又有很好的选择性。对于弱酸性成分应调节水相的pH≤Ka-2。而弱碱性成分应调节水相的pH≥PKa+2（此处为其共轭酸的pKa），以使弱酸、弱碱性成分主要以非离子化的游离酸、或碱形式存在，而提高萃取率。在提取过程中也常利用中性盐的盐析作用，如水相用NaCl饱和，使被测组分进入有机相而提高提取率。第二节含量测定样品的处理⒉离子对萃取法：其原理是在适当的pH介质中，某些有机酸（碱）性物质形成的离子与带相反电荷的离子（也称离子对试剂）定量地结合成为弱极性的离子对，而易溶于有机溶剂，使之萃取分离。它最适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取（不能用直接法萃取），在中药制剂分析中主要用于生物碱（B）的分析，其离子对试剂常为酸性染料（In-）如溴麝香草酚蓝（BTB）和溴甲酚绿（BCG）等，在水相中的定量反应为BH+（水相）+In_(水相)BH+·In-（水相）BH+·In-（有机相）形成的离子对BH+·In-常用成氢键能力强的氯仿或二氯甲烷提取。由上反应可知要求水相中生物碱和酸性染料均有较高的离子化程度，因此必须注意水相的pH和离子对试剂的选择。通常生物碱与BTB形成1∶1的离子对，最好在pH5.2～6.4提取，而二元碱形成1∶2离子对，最好在pH3.0～5.8提取（二元碱的碱性弱，需要在较低的pH下离子化后形成离子对）。若氯仿层中的微量水份引起浑浊，可通过加入少许乙醇或久置分层变得澄清，也可分离有机相后加入脱水剂（常用无水Na2SO4）或经滤纸滤过除去微量水份，另外液一液萃取时应尽量避免发生乳化现象。第二节含量测定样品的处理（四）色谱法吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中的净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液—固萃取（LSE）具有设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最常用，将在此做一简介。LSE通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长5`～15cm，内径0.5～1cm的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。用这种选择性好而柱效较低的方法进行样品的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测定，也可将色谱柱流出的样品进一步用GC、HPLC、TCL分离后测定。LSE的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶C8、C18、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。第二节含量测定样品的处理⒈硅胶、氧化铝等：它们是传统的吸附剂，多以0.07～0.15mm(200～100目)的颗粒1～5g用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂的样品加到柱上时非极性或低极性的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测定。例如用ＵＶ法（吸收系数法）硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，则可以将杂质和被测成分分离。另外，硅胶也和下面所述的硅藻土等一样，还可作亲水型填料使用，常见的商品硅胶柱为Sep-pakSilica，通常以甲醇、水处理后上样。⒉键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（简称C18或ODS）是常用的固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成分。也常用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药物。该类LSE的一般操作程序为：1)柱的活化。用2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用0.5毫升水洗去柱中的甲醇。2)上样。3)清洗。用2～5ml的水清洗以除去弱保留的亲水成分，如无机盐、氨基酸、亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、低肽等。4)