第四章抗体制药

第四章抗体制药第一节概述1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开创了抗体制药。1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。抗体是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibodyMcAb）。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。第二节单克隆抗体单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛。多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。一、抗原与动物免疫为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法。体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。脾内免疫法即在麻醉下直接将0.1～0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10μg。体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。体外免疫法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml，在5%CO237℃下培养4～5天，再分离脾细胞，进行细胞融合。细胞融合的方法：脾细胞（1×108）骨髓瘤细胞（2×107）混合聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。PEG相对分子量4000，浓度为50%二甲基亚砜增加融合率。细胞融合后可产生多种融合：脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞。选择性培养：培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。A阻断DNA合成。筛选阳性克隆常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。三、筛选阳性克隆与克隆化杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。单抗进行Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。亲和力、特异性、纯度、分子量测定。四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定五、单克隆抗体的大量制备体外培养法可获的10μg/ml抗体体内诱生法可获的5～20mg/ml抗体用BALB/c小鼠。降植烷接种杂交瘤细胞取腹水离心上清。依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：1.离心取上清，超滤，盐析。2.分离⑴凝胶过滤用于IgGIgM单抗纯化。⑵阴离子交换层析IgG单抗纯化。⑶亲和层析IgG单抗纯化。六、单克隆抗体的纯化第三节鼠源性单克隆抗体的改造杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。目的：降低免疫源性；降低相对分子量。人-鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体。一、人鼠嵌合抗体抗原抗体结合功能—抗体可变区（V）同种性免疫源性—抗体稳定区（C）在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。二、改形抗体（CDR移植抗体）Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫原性。三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子量为原抗体的1/80～1/3。即保留CDR区，而Ig分子中的C区不表达。小分子抗体类型有：①Fab片段抗体；②Fv抗体；③单链抗体；④单域抗体；⑤最小识别单位。单链抗体的优点：①可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。②易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。③免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应。单链抗体大多在大肠杆菌中表达，有三种形式：①直接在细胞质中表达；②与其它菌体融合表达融合蛋白；③分泌表达具有功能的单链抗体。四、双功能抗体双功能抗体就是双特性抗体。它是一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。构建方法：⒈化学交联法⒉生物学方法（杂种-杂交瘤）⒊基因工程法五、抗体融合蛋白抗体融合蛋白广义属双功能抗体。类型：①配基-配基型融合蛋白；②配基-Ig型嵌合蛋白；③配基-Fv型融合蛋白；④受体-Fv型融合蛋白；⑤酶-抗体型融合蛋白；第四节基因工程抗体和抗体工程抗体研究进展3个阶段：①1890年白喉抗毒素，多克隆抗体；②1975年杂交瘤技术单克隆抗体；③1994年基因工程抗体。一、噬菌体抗体库技术的基本方法⒈获取目的基因⒉抗体库技术的载体⒊淘筛⒋表达与鉴定二、噬菌体抗体库技术的特点⒈模拟天然全套抗体库⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术⒊可获得高亲和力的人源化抗体三、基因工程抗体表达⒈原核细胞表达⒉真核细胞表达⒊转基因植物表达⒋转基因动物表达第五节抗体诊断试剂⒈鉴定病原菌的抗体试剂⑴常用诊断血清的品种和用途①沙门氏菌属诊断血清②志贺氏菌属诊断血清③病原性大肠埃希氏菌诊断血清一、血清学鉴定用的抗体类试剂⑵诊断血清的制备步骤①制备细菌抗原②免疫动物和制备抗体血清⑶诊断血清诊断方法⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂⒊妊娠诊断试剂⒋抗ABO血型系统血清二、免疫标记技术用的抗体类试剂⒈荧光抗体诊断试剂⑴荧光抗体的制备⑵免疫荧光测定方法⒉免疫酶抗体诊断试剂⑴免疫酶染色法用抗体诊断试剂⑵酶免疫测定用抗体诊断试剂①HBsAg酶标诊断试剂②HBeAg酶标诊断试剂③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标抗体诊断试剂⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊断试剂⑥癌胚抗原（CEA）的酶标抗体诊断试剂⒊放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。放射性核素标记抗体的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法抗原的测定有：①夹心法；②间接法；③竞争法常用标记抗体试剂有：①HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂②HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂③HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂④AFP放射性核素标记抗体诊断试剂⑤CEA放射性核素标记抗体诊断试剂三、导向诊断药物放射性核素标记抗体肿瘤放射免疫显像放射免疫显像优点：①在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%，灵敏度达100%。②在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检出肺脑的转移灶。③小分子抗体易到达肿瘤部位，可显著提高N/NT值。④抗体在肿瘤部位可保留6～9日⑤能观擦抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应。放射免疫显像定位技术将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成Ab-DTPA，再注入体内后，就能与体内组织相结合。由于抗体分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DTPA是重金属离子络合剂，所以In-113M可以结合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。这一过程在2小时内可完成。建立预定位技术需解决3个问题：①抗体在肿瘤组织滞留要7天以上；②Ab-DTPA偶联物比较稳定；③内源性金属离子对DTPA的封闭作用要小。第六节抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。一、放射性核素标记的抗体治疗药物⒈常用的抗癌药物氨甲喋呤（MTX）、阿霉（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。二、抗癌药物偶联的抗体药物⒉抗体类药物逆转耐药性肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（MDR）。MDR是由基因调控的，其编码蛋白称为P糖蛋白，其中P170是与肿瘤耐药相关的主要蛋白，由Mdr1基因编码，1280氨基酸残基，分子量170K。认为P蛋白是ATP酶依赖性药泵，药物进入细胞后与P蛋白结合，利用ATP水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。⒈免疫毒素及其换代制品在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。三、毒素偶联的抗体药物第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。⒉免疫毒素的制备方法⑴毒素的来源细菌毒素植物毒素⑵载体的种类①小分子抗体FV或SCFV②细胞生长因子③激素④CD4⑶制备方法先克隆毒素基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经改造的毒素基因，再与载体基因重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，再经过纯化就得到重组免疫毒素。⒊免疫毒素的临床应用治疗肿瘤、自身免疫病，并能克复组织移植排斥反应，可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。