细菌药敏试验及耐药机制研究进展

细菌药敏试验及耐药机制研究进展安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学临床检验诊断学教研室安徽医科大学第一附属医院检验科徐元宏一、药敏试验种类1、纸片扩散法2、稀释法稀释法包括宏量肉汤稀释法(macrodilutiontest)、微量肉汤稀释法(microdilutiontest)、琼脂稀释法(agardilutiontest)。3、E-test法细菌药敏试验-宏量稀释法•Minimalinhibitoryconcentration(MIC)•Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels104cfu4210.50.250.120mg/ml微量液体稀释法细菌药敏试验-E-test法•E-test•Stripscontainingagradientofantibioticareplacedonlawnofbacteriaandincubatedovernight.MICisdeterminedatpointwherezoneofinhibitionintersectsscaleonstrip.•CombineseaseofKBwithanMICmethod.ParticularlyusefulforS.pneumoniae.二、药敏试验基本条件1.肠杆菌科－纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton琼脂接种物生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35℃±2℃；空气；16-18小时推荐的质控菌株大肠埃希菌ATCC25922；大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）（1）对于从粪便中分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试和报告氨苄西林，一种喹酮类药和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。此外对于胃肠外分离的沙门菌属还一定要测试并报告氯霉素及其某一种Ⅲ代头孢菌素的结果。（2）所有确认产ESBLs的菌株应当报告为耐所有青霉素类，头孢菌素类和氨曲南。（3）出于对流行性，治疗及感染控制方面的考虑，应该把从尿中分离的所有菌株做ESBLs筛选试验作为一个基本制度。（4）仅当被认为与临床有关时（如菌血症）才进行奇异变形杆菌ESBLs筛选试验（5）肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属可发展为耐药。最初分离的敏感菌株在开始治疗3~4天内可变为耐药，因此对重复分离菌株应重新进行药敏试验。。2.铜绿假单胞菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton琼脂接种物生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35℃±2℃；空气；16-18小时推荐的质控菌株大肠埃希菌ATCC25922；铜绿假单胞菌ATCC27853；大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）用纸片扩散法能可靠地测定分离于囊性纤维化病人的铜绿假单菌的敏感性，但在作为敏感结果报告前，应将孵育时间延长至24小时。3.不动杆菌属纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton琼脂接种物生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35℃±2℃；空气；20-24小时推荐的质控菌株大肠埃希菌ATCC25922；铜绿假单胞菌ATCC27853；大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）4.洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton琼脂接种物生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35℃±2℃；空气；20-24小时推荐的质控菌株大肠埃希菌ATCC25922；铜绿假单胞菌ATCC27853；大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）（1）洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法解释标准抑菌环直径（mm）相对应MIC值（μg/ml）试验/报告分组抗微生物药纸片含药量RISRS注释头孢类（注射药物）（包括头孢菌素Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ代）B头孢他啶30μg≤1718-20≥21≥32≤8碳青霉烯类B美洛培南10μg≤1516-19≥20≥16≤4四环素类B米诺环素30μg≤1415-18≥19≥16≤4叶酸代谢途径抑制剂A甲氧苄啶/磺胺甲噁唑1.25/23.75μg≤1011-15≥16≥8/152≤2/38（2）洋葱伯克霍尔德菌液体稀释法、琼脂稀释法解释标准MIC值（μg/ml）试验/报告分组抗微生物药SIR注释β内酰胺类/β内酰胺类抑制剂B替卡西林/克拉维酸≤16/232/2-64/2≥128/2头孢类（注射药物）（包括头孢菌素Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ代）B头孢他啶≤818≥32碳青霉烯类B美洛培南≤48≥16四环素类B米诺环素≤48≥16氟喹诺酮类B左氧沙星≤24≥8phenicolsB氯霉素≤816≥32叶酸代谢途径抑制剂A甲氧苄啶/磺胺甲噁唑≤2/38-≥4/765.嗜麦芽窄食单胞菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂、CAMHB、Mueller-Hinton琼脂接种物生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35℃±2℃；空气；20-24小时推荐的质控菌株大肠埃希菌ATCC25922；铜绿假单胞菌ATCC27853；大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）（1）嗜麦芽窄食单胞菌纸片扩散法解释标准抑菌环直径（mm）相对应MIC值（μg/ml）试验/报告分组抗微生物药纸片含药量RISRS注释四环素类B米诺环素30μg≤1415-18≥19≥16≤4氟喹诺酮类B左氧氟沙星5μg≤1314-16≥17≥8≤2叶酸代谢途径抑制剂A甲氧苄啶/磺胺甲噁唑1.25/23.75μg≤1011-15≥16≥8/152≤3/38（2）嗜麦芽窄食单胞菌液体稀释法、琼脂稀释法解释标准MIC值（μg/ml）试验/报告分组抗微生物药SIR注释β内酰胺类/β内酰胺类抑制剂B替卡西林/克拉维酸≤16/232/2-64/2≥128/2头孢类（注射药物）（包括头孢菌素Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ代）B头孢他啶≤816≥32四环素类B米诺环素≤48≥16氟喹诺酮类B左氧沙星≤24≥8phenicolsB氯霉素≤816≥32叶酸代谢途径抑制剂A甲氧苄啶/磺胺甲噁唑≤2/38-≥4/766.葡萄球菌属纸片扩散法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂接种物直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35±2℃；空气；16－18小时；测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需24小时。试验温度超过35℃不能检测MRS。推荐的质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923；大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）；金黄色葡萄球菌ATCCBAA-977和金黄色葡萄球菌ATCCBAA-976（用于克林霉素诱导试验质量评估）7.葡萄球菌属液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基肉汤稀释法：CAMHB；2％NaCL+CAMHB用于检测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林；琼脂稀释法：Mueller-Hinton琼脂；2％NaCL+MHA用于检测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林接种物直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35±2℃；空气；16－18小时；测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需24小时。试验温度超过35℃不能检测MRS。推荐的质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213；大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）；金黄色葡萄球菌ATCCBAA-977和金黄色葡萄球菌ATCCBAA-976（用于克林霉素诱导试验质量评估）8.肠球菌属纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂，CAMHB,MHA接种物生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35℃±2℃；空气；16-18小时；测万古霉素需24小时推荐的质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923(Mueller-Hinton琼脂);粪肠球菌ATCC29212（1）对于肠球菌属，头孢菌素，氨基糖苷类（筛选高水平耐药除外），克林霉素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑可以在体外显示活性但临床上无效，因此这些菌株不应该报告为敏感。（2）肠球菌心内膜炎要求大剂量青霉素或氨苄西林，或万古霉素或替考拉宁联合庆大霉素或链霉素以增加杀菌作用。（3）庆大霉素和链霉素筛选试验，能够预测氨苄西林、青霉素或万古霉素与一种氨基糖苷类抗生素之间的协同效应。其它的氨基糖苷类不需进行测试，因为它们对肠球菌的活性并不优于庆大霉素和链霉素。（4）对血和脑脊液分离株推荐用头孢硝噻吩β-内酰胺酶试验。β-内酰胺酶试验阳性提示青霉素耐药，同时也对酰胺基，羧基和脲基青霉素耐药。9.流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌纸片扩散法、液体稀释法试验条件培养基嗜血杆菌试验培养基(HTM)，HTM肉汤接种物直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准孵育35℃±2℃；5%CO2;16-18小时（纸片扩散法）；空气，20-24小时（液体稀释法）推荐的质控菌株流感嗜血杆菌ATCC49247；流感嗜血杆菌ATCC49766；大肠埃希菌ATCC35218（测试阿莫西林/克拉维酸时）10.淋病奈瑟菌纸片扩散法、琼脂稀释法试验条件培养基GC琼脂基础+1%特定的生长补充品。纸片扩散法不需要使用无半胱氨酸的生长补充品。接种物直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准孵育36℃±1℃(不超过37℃)；5%CO2；20-24小时。推荐的质控菌株淋病奈瑟菌ATCC4922611.肺炎链球菌片扩散法、液体稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂+5%羊血；CAMHB+2.5~5%V/V融解的马血接种物直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准孵育35℃±2℃；5%CO2；20-24小时推荐的质控菌株肺炎链球菌ATCC49619（1）肺炎链球菌对苯唑西林的抑菌环≥20mm的菌株对青霉素敏感(MIC≤0.06μg/ml)（2）苯唑西林的抑菌环≤19mm的菌株应当测定青霉素、美洛培南和头孢噻肟或头孢曲松的MICs12.肺炎链球菌之外其它链球菌的纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂+5%羊血;CAMHB+2.5~5%V/V融解的马血；Mueller-Hinton琼脂+5%羊血接种物直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准孵育35℃±2℃；5%CO2；20-24小时（纸片扩散法、琼脂稀释法）；空气，20-24小时（液体稀释法）推荐的质控菌株肺炎链球菌ATCC4961913.幽门螺杆菌的琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂+5%羊血接种物生长法或直接菌落悬液法，相当于2麦氏标准。孵育35℃±2℃；微需氧；3天推荐的质控菌株幽门螺杆菌ATCC43504幽门螺杆菌的琼脂稀释法解释标准MIC值（μg/ml）试验/报告分组抗微生物药SIR注释大环内酯类A克拉霉素≤0.250.5≥1.014.霍乱弧菌纸片扩散法、液体稀释法、琼脂稀释法试验条件培养基Mueller-Hinton琼脂，CAMHB,MHA接种物生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育35℃±2℃；空气；16-18小时推荐的质控菌株大肠埃希菌ATCC25922（1）霍乱弧菌纸片扩散法解释标准抑菌环直径（mm）相对应MIC值（μg/ml）试验/报告分组抗微生物药纸片含药量RISRS注释青霉素类A氨苄西林10μg≤1314-16≥17≥32≤8四环素